Статьи по ветеринарии свиней на Piginfo | Ограничения метода ПЦР в диагностике РРСС

Печать

Ограничения метода ПЦР в диагностике РРСС

Методом ПЦР можно обнаружить вирус в, практически, любом материале, но означает ли это, что если проба содержит вирус, то этот вирус заразен? Годится ли любой ПЦР-тест для любого штамма?


Для обнаружения РРСС наиболее широко используются два метода: ПЦР и ИФА (ELISA). В настоящей статье мы сконцентрируемся на ПЦР, методе, способном обнаружить вирус в, практически, любом материале. Он основан на полимеразной цепной реакции ДНК, или, в случае с РРССв, областей комплементарной ДНК (кДНК), фланкированных короткими последовательностями, с которыми специфичные ДНК-праймеры связываются на каждом ПЦР-цикле. Чувствительность и избирательность диагностических тестов, использующих ПЦР, зависят от того, насколько эти праймеры соответствуют своим целям и от термических циклов в процессе циклической амплификации. В идеале, они должны быть комплементарны только геному заданной разновидности вирусов, не связываясь ни с какими другими микробами или цепочками хозяйской ДНК, при этом, способными определять геномы всех штаммов или вариантов этих видов вирусов. Таким образом, они нацелены на наиболее консервативные области генома.


Вирус РРСС (РРССв) – один из самых сложных для разработки высокочувствительных и специфичных тестов ПЦР возбудителей. Известные в настоящее время вирусы РРСС относятся к двум видам: РРССв-1 и РРССв-2. Обе эти разновидности распространились по всему миру, при этом, РРССв-1 доминирует в Европе, а РРССв-2 – в Америке и Азии. Можно предположить, что генетическое разнообразие доминирующей разновидности РРССв выше, чем таковое вида с меньшей превалентностью. На практике, ПЦР-тесты, используемые, например, в Европе или Америке, могут быть более валидированы и лучше приспособлены к выявлению РРССв-1 или РРССв-2, соответственно. В результате, некоторые штаммы менее распространенных разновидностей на данной территории, или континенте, могут остаться незамеченными, а их роль в патогенезе РРСС – недооцененной. Это особенно важно, если речь идет о фермах, где РРССв-1 и РРССв-2 циркулируют совместно. Огромная генетическая изменчивость вирусов РРСС требует постоянного обновления последовательностей ПЦР-праймеров и зондов, чтобы поспеть за непрестанной эволюцией вируса и за появлением совершенно новых генетических вариантов. Особенно это относится к РРССв-1, чья крайняя генетическая изменчивость, вкупе с малодоступностью референсных вирусов из России, Беларуси и Украины представляют угрозу в плане нарушения чувствительности имеющихся на рынке комплектов ПЦР-тестов к Восточноевропейским генетическим подтипам РРССв-1.


В настоящее время такой вариант, как ПЦР в реальном времени, используется для, преимущественно, повседневной диагностики. Существует несколько методов ПЦР в реальном времени, отличающихся по своим принципам, но наиболее широко применяемым из них является метод с использованием так называемых TaqMan-зондов. TaqMan-зонд – это короткая область ДНК (олигонуклеотид), помеченная флуорофорами, которая связывает ДНК-мишень между фланкирующими праймерами. Если связывание произошло, зонд в лизирует в процессе полимеризации ДНК и флуоресцентное свечение регистрируется оборудованием. Особенно ПЦР в реальном времени подходит для мультиплексирования диагностических мишеней. Это означает, что одной ПЦР-реакцией (или одним тестом) можно выявить 2-3 различных патогена – по флуоресцентному свечению 2-3 различных красителей. Таким образом, одновременно обе разновидности РРССв могут легко быть обнаружены и дифференцированы в пробах, полученных от одного животного, из станка или со всей фермы.



Расшифровка результатов ПЦР обманчиво проста. Ветеринарные специалисты должны быть в курсе некоторых ограничений данного метода и быть в состоянии критично подходить к расшифровке результатов. Например, положительный результат ПЦР подтверждает присутствие полинуклеотида-мишени (т.е., РРССв) в пробе. Тем не менее, этот результат не доказывает, что в пробе содержится патогенный вирус. ПЦР в реальном времени позволяет квантифицировать вирус в пробе. Ее результаты выражаются в виде «порогового цикла» (Пц). Это первый цикл, на котором зафиксировано флуоресцентное свечение из реакционной пробирки. Чем ниже порядковое число цикла, тем выше число копий ДНК-мишени (читай, число копий вируса). Например, проба с Пц 20 может считаться в высокой степени положительной, а проба с Пц 35 – в низкой степени положительной. Тем не менее, в некоторых случаях флуоресценция обнаруживается только лишь на очень поздних циклах ПЦР в реальном времени, т.е., >38. Как такие высокие значения могут быть истолкованы? К несчастью, не всегда такой результат отражает присутствие очень небольшого количества копий вируса в образце. Эти, так называемые, «засони» могут быть результатом самопроизвольного выхода зонда из строя в результате большого числа термальных циклов ПЦР, что будет выглядеть как энзимный нуклеозис, вызванный ДНК-полимеразой. Стало быть, такое может произойти даже при отсутствии нуклеиновой кислоты вируса в пробе. Правильная интерпретация «засонь» при мониторинге свободных от РРССв популяций имеет важнейшее значение. Должна проводиться повторная диагностика, включая ИФА (ELISA). К несчастью, некоторые европейские диагностические лаборатории не предоставляют клиентам точные значения Пц при ПЦР в реальном времени. Вместо этого, результаты показываются как положительные или отрицательные. Полезность таких отчетов для практических специалистов весьма ограничена, а в некоторых случаях они могут стать причиной принятия неправильных решений в плане схем борьбы с РРССв.


Практические соображения


Ни один из современных методов ПЦР не способен выявить все вируса РРСС.


Отрицательный результат ПЦР-анализа нескольких случайным образом забранных на ферме проб не доказывает отсутствие на ней РРССв-инфекции.


Положительный результат ПЦР доказывает присутствие в образце нуклеиновой кислоты РРССв, но не его, вируса, инфективность.



Автор: Tomasz Stadejek

Источник: pig333.ru

Печать
700
17.03.2019

Статьи партнеров

1.Вступление Искусственное осеменение (ИО) является предпочтительным методом размножения в большинстве систем интенсивного свиноводства во всем мире. Для рентабельного произво...

12.09.2020 206

Автор: Кларенс Фрозе, Магистр наук в области сельского хозяйства, директор по кормлению, Genesus Inc. В этой статье будет рассмотрено, как можно повлиять на суточное потре...

10.09.2020 270

Благодаря сотрудничеству и обмену опытом с мировыми генетическими компаниями, мы можем обеспечивать комплексную поддержку и развитие наших клиентов. Сегодня мы пообщались с техни...

08.09.2020 232

К. Кравченко, М. Сафонов, ООО «Инновационное предприятие «Апекс плюс» Не секрет, что оптимизация издержек и снижение себестоимости продукции на сегодняшний день ...

31.08.2020 139

Искусственное осеменение (ИО) является предпочтительным методом размножения в большинстве систем интенсивного свиноводства во всем мире. Для рентабельного производства семени нео...

31.08.2020 277

Традиционное искусственное осеменение представляет собой введение готовой спермодозы в каудальную часть шейки матки. При использовании этого метода, от 2,5 до 3 млрд сперматозоид...

28.08.2020 365

Ф.А. ШИРЯЕВ, кандидат вет. наук, технический специалист подразделения поработе с ключевыми клиентами по направлению «Свиноводство», ООО «Зоэтис». Репродуктивно-респираторный...

28.08.2020 261

Считается, что свежеубранное зерно с поля является «чистым» от микотоксинов, которые появляются в нем уже позже, во время хранения. К сожалению, это не так. В процессе роста и со...

26.08.2020 610

Инфекционный атрофический ринит свиней в России появился с 1895 г. Впервые заболевание было описано в 1829 г. Франком в Германии. Позже с 1932 года заболевание стало известно в С...

25.08.2020 136

На протяжении длительного времени ведущие компании в сфере искусственного оплодотворения давали четкие рекомендации по гомогенизации (переворачиванию) семени в процессе хранения,...

25.08.2020 181

Семя хряка очень чувствительно к росту бактерий. Бактериальная контаминация может возникнуть на всех этапах производства доз – от сбора до фасовки. В этой статье мы рассмотрим ис...

19.08.2020 244