Добавка с бутиратом натрия для свиноматок в период средней и поздней беременности повышает антиоксидантную способность и уменьшает воспаление у поросят

Период беременности сопряжен с высокой метаболической нагрузкой на организм матери. У свиноматок это часто приводит к развитию окислительного стресса — состоянию дисбаланса между продукцией активных форм кислорода (АФК) и способностью антиоксидантной системы организма к их нейтрализации. Многочисленные исследования подтверждают, что окислительный стресс у матери во время беременности может нарушать нормальное развитие плода и негативно сказываться на его росте после рождения.

Существует прямая корреляционная связь между уровнем окислительного стресса у матери и воспалительным статусом новорожденного. Например, повышенное содержание малонового диальдегида (МДА) — ключевого маркера перекисного окисления липидов — в плазме крови матери связано с более высокими концентрациями провоспалительных цитокинов, таких как интерлейкин-6 (IL-6) и IL-7, у новорожденных. Это указывает на то, что окислительное повреждение у матери может программировать провоспалительный фенотип у плода.

Новорожденные поросята особенно уязвимы к окислительному стрессу. Их антиоксидантная система развита недостаточно, и они обладают ограниченной способностью к детоксикации АФК. Эта физиологическая незрелость делает их крайне восприимчивыми к повреждению клеточных мембран, ДНК и белков в первые дни жизни, что может иметь долгосрочные последствия для их здоровья и продуктивности. В связи с этим, разработка стратегий, направленных на усиление антиоксидантной защиты и поддержку созревания иммунной системы плода и новорожденного, является приоритетной задачей современного свиноводства.

Бутират натрия (NaB) — соль масляной кислоты, короткоцепочечной жирной кислоты, продуцируемой микрофлорой толстого кишечника. В последние годы NaB привлекает все больше внимания благодаря своим доказанным антиоксидантным и противовоспалительным свойствам у различных видов животных. Исследования на поросятах-отъемышах показали, что добавление NaB в рацион снижает индуцированный бактериальными липополисахаридами (LPS) всплеск провоспалительных цитокинов в крови. Также было продемонстрировано, что NaB и его производные (например, трибутирин) способствуют улучшению показателей роста у поросят в условиях иммунного стресса.

Накопленные данные свидетельствуют о том, что питательные вещества с биоактивными свойствами, поступающие в организм свиноматки, могут оказывать программирующее воздействие на развитие потомства, улучшая его антиоксидантные и иммунные способности. Предыдущие работы показали, что добавление 0,1% NaB в рацион свиноматок с 85-го дня супоросности до отъема повышает экспрессию генов белков плотных контактов (CLDN1, TJP1) и противовоспалительного цитокина IL-10 в тощей кишке поросят-сосунов. Однако влияние добавок NaB на протяжении всей поздней супоросности (начиная с 30-го дня) на антиоксидантную способность и воспалительный статус поросят в момент рождения и после отъема остается малоизученным.

В настоящем исследовании мы выдвинули гипотезу, что диетическое добавление 0,2% бутирата натрия в рацион свиноматок в течение всего периода супоросности способно ослабить окислительный стресс и снизить воспалительную нагрузку у их потомства.

2. Материалы и методы

2.1. Животные и дизайн эксперимента

В исследовании использовались супоросные свиноматки (Ландрас × Йоркшир). С 30-го по 114-й день супоросности животные были разделены на две группы:

- Контрольная группа (Con, n=16): получали стандартный рацион для супоросных свиноматок.

- Группа бутирата натрия (NaB, n=16): получали стандартный рацион, дополненный 0,2% бутирата натрия.

В период лактации обе группы получали одинаковый базовый рацион.

Для минимизации вариаций внутри групп, на момент опороса из каждой группы были отобраны по 8 свиноматок. Критериями отбора служили размер гнезда и общая масса гнезда при рождении, максимально близкие к средним показателям по своей группе. От каждой из отобранных свиноматок одного новорожденного поросенка-самца с массой тела, близкой к средней по гнезду, подвергали эвтаназии до приема молозива. У этих поросят и соответствующих им плацент были отобраны образцы для дальнейшего анализа.

При отъеме (21-й день лактации) из каждой группы были отобраны еще по 6 свиноматок на основе веса их гнезда при отъеме. От каждой из них был отобран один поросенок-самец для взятия образцов сыворотки крови и тканей кишечника.

2.2. Сбор образцов

Образцы плаценты собирали непосредственно после опороса, отбирая ткань из центральной части во избежание влияния участков, контактирующих с тканями матери и плода. Часть образцов фиксировали в 4% параформальдегиде для гистологии, остальные замораживали в жидком азоте и хранили при -80°C.

Образцы крови у новорожденных и отъемных поросят брали из передней полой вены. После центрифугирования сыворотку хранили при -20°C для биохимического анализа и иммуноферментного анализа (ИФА).

После эвтаназии у поросят извлекали внутренние органы (сердце, печень, легкие, селезенку, почки, желудок) и сегменты тонкого кишечника (двенадцатиперстную, тощую и подвздошную кишки). Органы взвешивали для расчета индексов, измеряли длину отделов кишечника. Ткани замораживали в жидком азоте и хранили при -80°C для молекулярного анализа.

2.3. Молекулярно-биологический анализ

Выделение РНК и количественная ПЦР в реальном времени (qPCR). Тотальную РНК выделяли из тканей плаценты, тощей и подвздошной кишки с использованием реагента TRIzol. Концентрацию и чистоту РНК определяли на спектрофотометре NanoDrop 2000. Один микрограмм тотальной РНК использовали для обратной транскрипции в кДНК. Количественный ПЦР-анализ проводили с использованием SYBR Green на системе QuantStudio™ 5. Относительный уровень экспрессии мРНК целевых генов рассчитывали по методу 2^–ΔΔCt, используя GAPDH в качестве референсного гена. Список использованных праймеров (таблица 3) включает гены антиоксидантной защиты (SOD2, GPX1-4, CAT, GCLC и др.), воспалительных цитокинов (IL6, IL8, IL10, TNF, IL1B), апоптоза (BAX, BCL2), белков плотных контактов (CLDN1, OCLN, TJP1) и рецепторов короткоцепочечных жирных кислот (GPR41, GPR43).

2.4. Биохимический анализ и ИФА

В сыворотке крови и гомогенатах тканей определяли активность ключевых антиоксидантных ферментов: глутатионпероксидазы (GPX), супероксиддисмутазы (SOD), каталазы (CAT), а также общую антиоксидантную способность (T-AOC) и концентрацию малонового диальдегида (МДА) с использованием коммерческих наборов (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute). Концентрации провоспалительных (IL-6, TNF-α) и противовоспалительного (IL-10) цитокинов в сыворотке определяли методом ИФА с помощью наборов, специфичных для свиней (4A Biotech Co.).

2.5. Гистологический анализ

Сегменты тощей кишки отъемных поросят фиксировали в 4% параформальдегиде. После стандартной проводки и заливки в парафин, срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Морфометрию (высоту ворсинок и глубину крипт) проводили под микроскопом.

2.6. Статистический анализ

Статистический анализ выполняли с использованием программного обеспечения SAS 9.4. Экспериментальной единицей считали свиноматку. Для сравнения двух групп применяли непарный двусторонний t-критерий Стьюдента. Данные представлены как среднее значение со стандартной ошибкой среднего (SEM). Различия считали статистически значимыми при P < 0,05; тенденцию к различию признавали при 0,05 ≤ P < 0,1.

3. Результаты

3.1. Влияние NaB на антиоксидантный статус плаценты

Добавление NaB в рацион супоросных свиноматок оказало выраженное положительное влияние на антиоксидантную систему плаценты. В группе NaB наблюдалось статистически значимое повышение общей антиоксидантной способности (T-AOC) плаценты (P < 0,01) и тенденция к увеличению активности каталазы (P = 0,073) по сравнению с контролем.

Анализ экспрессии генов подтвердил эти наблюдения. В плаценте свиноматок, получавших NaB, была значительно повышена экспрессия генов ключевых антиоксидантных ферментов митохондриальной супероксиддисмутазы (SOD2) и глутатионпероксидазы 4 (GPX4) (P < 0,05) (Рис. 2A). Также была отмечена тенденция к повышению экспрессии гена каталитической субъединицы глутамат-цистеинлигазы (GCLC) — фермента, лимитирующего скорость синтеза глутатиона, и гена цитохрома P450 1A1 (CYP1A1), участвующего в детоксикации ксенобиотиков. При этом значимых изменений в экспрессии генов, связанных с воспалением (IL6, TNF и др.), в плаценте обнаружено не было.

3.2. Влияние материнского приема NaB на новорожденных поросят

У новорожденных поросят из группы NaB наблюдались изменения в массе некоторых органов. Было отмечено достоверное снижение абсолютной и относительной массы селезенки (P < 0,01) и тенденция к снижению массы подвздошной кишки (P = 0,093) (Таблица 4). Длина подвздошной кишки также была значительно меньше в группе NaB (P = 0,022).

На системном уровне добавка NaB привела к значительному улучшению антиоксидантного статуса новорожденных. В сыворотке крови поросят из группы NaB была повышена активность каталазы (P < 0,05) и, что наиболее важно, значительно снижена концентрация малонового диальдегида (МДА) (P < 0,05), что свидетельствует об уменьшении интенсивности процессов перекисного окисления липидов.

В подвздошной кишке новорожденных поросят из группы NaB наблюдалась интересная картина экспрессии генов. Экспрессия антиоксидантных генов GPX3 и GPX4 была значительно повышена (P < 0,05), тогда как экспрессия CYP1A1, GCLM и GPX2, напротив, была снижена (P < 0,05) по сравнению с контролем. Статистически значимых изменений в экспрессии воспалительных генов в подвздошной кишке новорожденных не наблюдалось.

Кроме того, материнская добавка NaB способствовала улучшению барьерной функции кишечника у новорожденных. В подвздошной кишке поросят из группы NaB была значительно повышена экспрессия гена рецептора короткоцепочечных жирных кислот GPR41 и гена белка плотных контактов клаудина-1 (CLDN1) (P < 0,05), а также наблюдалась тенденция к повышению экспрессии гена TJP1 (P = 0,07).

3.3. Влияние материнского приема NaB на поросят-отъемышей

К моменту отъема эффекты, обусловленные материнской добавкой NaB, проявились по-новому. У поросят из группы NaB наблюдалось значительное увеличение абсолютной и относительной массы селезенки и тощей кишки (P < 0,05), что контрастирует с данными, полученными у новорожденных.

Наиболее ярким результатом стало значительное снижение системного воспаления у отъемышей. Концентрация провоспалительных цитокинов IL-6 и TNF-α в сыворотке крови поросят из группы NaB была достоверно ниже, чем в контроле (P < 0,01). Снизился также уровень противовоспалительного цитокина IL-10 (P < 0,01), что, вероятно, является следствием общего уменьшения воспалительной нагрузки (Рис. 4A-C).

В тощей кишке отъемных поросят из группы NaB экспрессия мРНК IL6 была значительно ниже (P < 0,01), а экспрессия TNF имела тенденцию к снижению (P = 0,09). При этом значимых изменений в экспрессии антиоксидантных генов в кишечнике отъемышей не наблюдалось, как и различий в антиоксидантных показателях сыворотки крови.

Гистологический анализ тощей кишки выявил значительные структурные улучшения. У поросят из группы NaB высота ворсинок и соотношение высоты ворсинок к глубине крипт (VCR) были значительно выше, чем в контрольной группе (P < 0,05 и P < 0,01 соответственно). Это свидетельствует о лучшей всасывающей способности и более здоровом состоянии слизистой оболочки кишечника. Экспрессия генов барьерных белков в тощей кишке отъемышей при этом значимо не различалась между группами.

4. Обсуждение

Переход от внутриутробного развития к самостоятельной жизни является критическим периодом для поросят, сопровождающимся высокой физиологической нагрузкой. Незрелость антиоксидантной и иммунной систем делает их крайне уязвимыми к окислительному стрессу и воспалительным процессам, которые могут быть спровоцированы сменой питания, условиями содержания и микробной колонизацией. Результаты нашего исследования демонстрируют, что укрепление антиоксидантного статуса матери во время беременности с помощью бутирата натрия является эффективным инструментом для повышения жизнеспособности потомства на всех этапах раннего онтогенеза.

Укрепление материнской защиты. Первым ключевым результатом стало подтверждение того, что NaB, добавляемый в рацион свиноматки, способен достигать плаценты и модулировать ее функции. Повышение общей антиоксидантной способности плаценты и экспрессии генов SOD2, GPX4, GCLC указывает на то, что NaB усиливает способность этого важнейшего органа противостоять окислительному стрессу. Здоровая плацента с высоким антиоксидантным потенциалом — это первый и главный барьер, защищающий развивающийся плод от повреждения активными формами кислорода материнского происхождения. По сути, мы создаем более благоприятную внутриутробную среду для развития плода.

Программирование здоровья новорожденного. Улучшение состояния плаценты напрямую отразилось на статусе новорожденных поросят. Снижение веса селезенки у новорожденных из группы NaB может косвенно указывать на менее напряженную иммунную среду внутриутробно. Селезенка, как орган иммунной системы, реагирует на антигенную стимуляцию; ее меньший вес может быть признаком того, что плод не подвергался избыточному воспалительному стрессу благодаря защитным механизмам, активированным NaB в организме матери и плаценте.

Наиболее значимым для новорожденных является резкое снижение уровня МДА и повышение активности каталазы в сыворотке крови. Это прямое доказательство того, что «антиоксидантный капитал», переданный матерью, позволяет потомству более эффективно справляться с окислительным взрывом, неизбежно возникающим при рождении и переходе к легочному дыханию.

Изменения в экспрессии генов в подвздошной кишке новорожденных заслуживают особого внимания. Повышение GPX3 и GPX4 усиливает локальную защиту слизистой от окислительного повреждения. Снижение экспрессии CYP1A1 и GCLM может быть следствием меньшей потребности в детоксикации и синтезе глутатиона в условиях низкого окислительного стресса — организм не включает эти системы на полную мощность, так как в них нет необходимости. Одновременное повышение экспрессии GPR41 и CLDN1 указывает на то, что кишечник не только лучше защищен, но и лучше подготовлен к выполнению своих функций. GPR41 играет важную роль в иммунной регуляции кишечника, а CLDN1 необходим для формирования плотных контактов. Более раннее созревание барьерной функции кишечника закладывает фундамент для лучшего здоровья и усвоения питательных веществ в будущем.

Долгосрочные эффекты у отъемышей. К моменту отъема мы наблюдаем отложенный эффект материнской добавки. Увеличение массы селезенки у отъемышей из группы NaB, вероятно, отражает компенсаторный рост и функциональное созревание этого органа после рождения, когда иммунная система начинает активно сталкиваться с внешними антигенами.

Снижение уровня провоспалительных цитокинов (IL-6, TNF-α) в сыворотке крови является критически важным результатом. Отъем — это мощный стресс-фактор, который часто провоцирует системное воспаление, замедляющее рост и делающее поросят восприимчивыми к инфекциям. Тот факт, что поросята из группы NaB входят в этот период с более низким базовым уровнем воспаления, дает им огромное преимущество. Снижение IL-10 на этом фоне не должно настораживать; IL-10 — это противовоспалительный цитокин, и его уровень часто снижается вслед за снижением провоспалительных сигналов, так как необходимость в его компенсаторной продукции отпадает.

Улучшение морфологии кишечника (увеличение высоты ворсинок и соотношения VCR) является морфологическим субстратом лучшего здоровья. Более высокие ворсинки означают большую площадь всасывания, а более высокое соотношение VCR свидетельствует о здоровой и быстро обновляющейся популяции эпителиальных клеток. В сочетании со сниженным воспалением это обеспечивает лучший рост и развитие поросят в постнатальный период.

В совокупности полученные данные формируют стройную картину: материнская добавка NaB действует как «программирующий» фактор. Она снижает окислительный стресс в системе мать-плацента-плод, что приводит к рождению более устойчивых поросят с улучшенной антиоксидантной защитой и более зрелым кишечником. Эта начальная «преимущественная позиция» позволяет им легче перенести стресс отъема, демонстрируя более низкий уровень воспаления и лучшие морфофункциональные показатели кишечника.

5. Выводы

Диетическое добавление 0,2% бутирата натрия в рацион свиноматок на протяжении всей супоросности (с 30-го по 114-й день) оказывает многоплановое положительное влияние на здоровье потомства:

1. Улучшает антиоксидантный статус: NaB повышает антиоксидантную способность плаценты и снижает уровень окислительного стресса (МДА) у новорожденных поросят, одновременно повышая активность ключевых антиоксидантных ферментов.

2. Способствует развитию кишечника: Стимулирует экспрессию генов, отвечающих за барьерную функцию кишечника (CLDN1, TJP1, GPR41) у новорожденных, и улучшает морфологию слизистой (высота ворсинок) у поросят-отъемышей.

3. Снижает воспалительную нагрузку: Приводит к значительному снижению концентрации провоспалительных цитокинов (IL-6, TNF-α) в сыворотке крови поросят-отъемышей, облегчая протекание стрессового периода отъема.

Таким образом, включение бутирата натрия в рацион супоросных свиноматок является эффективной стратегией для повышения антиоксидантного и иммунного статуса потомства, улучшения развития их кишечника и, в конечном итоге, для укрепления здоровья поросят на ранних этапах жизни, что создает прочную основу для их дальнейшей высокой продуктивности. Несмотря на ограничения, связанные с неслучайным отбором животных на некоторых этапах работы, полученные данные убедительно доказывают потенциал использования NaB в качестве кормовой добавки для свиноматок и открывают перспективы для дальнейших исследований его долгосрочного влияния на продуктивные качества товарного молодняка.

Исследование: Animal