Реакции взаимодействия антиген - антител

Реакции между антигенами и антителами in vitro, имеющие диагностическое значе­ние, называли серологическими (от лат. sеrum - сыворотка), так как источником антител служила сыворотка крови. При появле­нии методов иммунохимического анализа серологические реакции стали одной из широкого набора реакций, выявляющих механизмы взаимодействия между антигенами и антителами. Если на раз­ных этапах развития иммунологии в качестве антител для постанов­ки серологических реакций использовали только сыворотку крови, теперь благодаря разнообразным методам выделяют из нее высоко­очищенные иммуноглобулины. для индикации и количественной оценки того или иного вещества антигенной природы предложены способы получения высокоспецифичных (моноспецифичных) ан­тител и высокочувствительные методы регистрации концентрации отдельных компонентов реакции антиген - антитело. Это стало возможным в связи с разработкой способов конъюгирования анти­генов и антител с флуоресцирующими красителями и ферментами, введения компонентов реакции антиген - антитело на различных типах носителей. Достижения современной иммунохимии позво­лили проводить реакции антиген - антитело на уровне, который вряд ли можно назвать серологическим, хотя источником антител продолжает оставаться сыворотка крови. Понятие «серологическая реакция» окончательно отпадает, когда речь заходит о взаимодей­ствии антигена с моноклональными антителами, получаемыми бла­годаря разработке гибридомной техники, и когда реакция анти­ген - антитело протекает при аллергии.

Антитела в зависимости от свойств антигена и условий взаимо­действия с ним обладают нейтрализующим, иммобилизирующим, коагулирующим (осаждающим) и лизирующим (растворяющим) действиями. Нейтрализующее действие проявляется в реакциях нейтрализации токсина антитоксином, иммобилизирующее - в иммобилизации некоторых микроорганизмов, коагулирующее - в реакциях агглютинации и преципитации, лизирующее - в реак­циях лизиса и связывания комплемента. Каждая из разновиднос­тей серологических реакций имеет свои варианты, а их постанов­ка - различные модификации, поэтому методические подходы к проведению реакций между антигеном и антителом довольно раз­нообразны.

Реакция нейтрализации (РН). В ходе реакции нейтрализации специфические антитела нейтрализуют вредное действие антигена, которое проявляется при попадании послед­него в организм. Если антигеном служит микробный экзотоксин (дифтерийный, столбнячный, ботулинический и др.), то специфи­ческие антитела нейтрализуют его. В организме происходит ней­трализация только свободного, не связавшегося с клетками токси­на. Обезвреживание токсина в ходе физико-химической реакции нейтрализации происходит за счет связывания его свободных ами­ногрупп, что приводит к потере токсичности. Если антигеном слу­жит вирусный материал, нейтрализующие антитела полностью подавляют специфическую активность вируса, выявляемую в раз­личных клеточных культурах, куриных эмбрионах и на подопыт­ных животных. Вирус перестает размножаться, теряет свою ин­фекционность.

Реакция агглютинации (РА). Различают прямую и непрямую, или пассивную, агглютинации. В прямой агглютина­ции в качестве антигена выступает сама микробная клетка или структурные компоненты ее поверхностной оболочки. Предел чувствительности реакции агглютинации микробов составляет 0,01 мкг азота белка антител в 1 мл.

Агглютинация обусловлена в большей степени особенностями строения клеточной оболочки и ее функциями, нежели свойства­ми агглютининов. Fab-фрагменты антител могут блокировать антигенные детерминанты, не приводя непосредственно к склеива­нию. Агглютинации способствует расположение антигенных ре­цепторов клеточной поверхности в виде скоплений. Если много­валентные агглютинины взаимодействуют одновременно с нес­колькими антигенными рецепторами, константа Ка повышается по сравнению с Ка для случаев соединения антитела с антигеном единичной связью.

При пассивной агглютинации растворимые антигены (белки, полисахариды и их комплексы микробного происхождения) со­единяются с нерастворимым носителем, выполняющим исключи­тельно индикаторную функцию. Носителями могут быть эритро­циты, частицы латекса, полиакриламида, бентонита и др. Связы­вание антигена с носителем происходит в результате адсорбции или химического взаимодействия. Микробные полисахариды, на­пример, адсорбируются на нативных эритроцитах без какой-либо их предварительной обработки. Различные белки (в том числе микробные фрагменты) возможно при соединить к эритроцитам, только обработав их различными химическими веществами, обла­дающими дубильным действием, - танином, хромахлоридом, фор­мальдегидом или бисдиазотированным бензидином. Такая об­работка предотвращает разрушение эритроцитов, которое может про изойти при непосредственном их контакте с антигеном. При условии, если антиген, связанный с носителем, соответствует ан­тителу, происходит агглютинация.

Реакция преципитации (РП). Реакция антиген­-антитело представлена преципитацией. Основана на осаждении антигена из раствора специфическими антителами. Комплекс ан­тиген - антитело выпадает в осадок только при определенных со­отношениях концентраций реагирующих молекул. Область этих соотношений, при которых в надосадочной жидкости после обра­зований преципитата не обнаруживаются ни свободные антигены, ни свободные антитела, называется зоной эквивалентности. Вне этой зоны, при избытке антител или антигена, феномен преципи­тации не происходит, так как образуется растворимый комплекс антиген - антитело. Реакция преципитации менее чувствительна, чем реакция агглютинации.

Существуют модификации реакции преципитации. Самый про­стой способ постановки -  кольцепреципитация, которую выполняют в пробирках путём наслоения на иммунную сыворотку раз­личных разведений прозрачного раствора антигена. На границе двух реагирующих систем через определенное время появляется опалесцирующее серо-белое кольцо преципитации. Именно та­ким образом при изучении стерильных фильтратов бульонных культур возбудителей холеры, брюшного тифа, чумы, сибирской язвы и соответствующих антисывороток в конце XIX века (1897) были обнаружены преципитины.

Реакция преципитации может быть поставлена в агаровом геле (иммунодиффузия по Ухтерлони). Принцип этого метода заклю­чается в следующем. Растворимые антигены и антитела вносят в лунки, вырезанные в геле на определенном расстоянии. Компо­ненты реакции диффундируют в слое агара навстречу друг другу, образуя в зоне контакта преципитат в виде мутной видимой линии преципитации.

Для более детальных иммунологических исследований приме­няют метод иммуноэлектрофореза, предложенный П. Грабаром и К. А. Уильямсом (1953). Вначале осуществляют электрофорети­ческое разделение антигена, представляющего собой зачастую смесь белковых или других молекул в забуференном агаровом геле. После разделения в канавку, которая идет в направлении миграции антигенных веществ, вносят преципитирующую сыво­ротку. Антиген и антисыворотка диффундируют в геле навстречу друг другу, и в месте их взаимодействия возникают дугообразные линии преципитации. По числу, положению и форме этих линий дают заключение о составе исходной смеси антигенов.

Реакция лизиса (РЛ). Лизирующее (растворяющее) действие антител наглядно проявляется в реакциях лизиса и свя­зывания комплемента. В основе реакций лизиса лежит взаимодей­ствие корпускулярных антигенов со специфическими антителами. Иммуноглобулины при содействии комплемента разрушают эри­троциты, ИЗ которых выходит гемоглобин и реагирующая смесь из мутной взвеси эритроцитов преобразуется в прозрачную красную жидкость, так называемую лаковую кровь. Реакция названа реак­цией гемолиза. Когда иммуноглобулины также при содействии комплемента разрушают оболочку бактериальной клетки, наблю­дается лизис бактерий - бактериолизис.

Реакция связывания комплемента  (РСК). Механизм действия наиболее сложный в сравнении с другими серологическими реакциями. В РСК участвуют две системы ан­тиген - антитело. Для визуальной регистрации связывания комплемента основной системой антиген - антитело в реакцию дополнительно вводят вторую, или индикаторную, систему, со­стоящую из взвеси эритроцитов и соответствующей антисыво­ротки (гемолитической сыворотки). Если основной комплекс антиген - антитело фиксировал в себе комплемент (в случае соответствия антигена антителу), то гемолиз отсутствует (положительная реакция). Если в основной системе антиген и антитело не соответствуют друг другу, то комплемент фиксируется на вто­ром индикаторном комплексе, вызывая гемолиз эритроцитов (ре­акция отрицательная). По чувствительности РСК примерно соот­ветствует реакции пассивной гемагглютинации.

Реакция иммунофлуоресценции (РИФ). В ос­нову иммунофлуоресцентного метода положено взаимодейст­вие антигена с антителом, при котором один из компонентов реакции (чаще антитело) обладает способностью к вторичной флуоресценции благодаря предварительному соединению с флуо­ресцентным красителем. Образовавшиеся таким образом им­мунные комплексы становятся хорошо видимыми, ярко светя­щимися структурами на темном фоне под флуоресцентным микроскопом. В качестве флуоресцентных красителей исполь­зуют флуоресцеин, изотиоцианат, родамин, В-изотиоцианат, лис­самин-родамин и другие, имеющие реакционно-способные груп­пы (сульфохлорид, изотиоцианат и др.), которые соединяются со свободными аминогруппами молекул антител, не теряя при обработке флуорохромами специфического связывания с соот­ветствующим антигеном.

Прямой инепрямой флуоресцентные методы. Прямой метод ос­нован на непосредственном специфическом соединении антигена с мечеными антителами. Непрямой метод - на поэтапном выяв­лении комплексов антиген - антитело с помощью флуоресцент­ных красителей. Первый этап заключается в образовании иммун­ных комплексов определенного антигена (например, бактериаль­ной клетки) со специфическими антителами (у-глобулинами) им­мунной сыворотки. Второй этап - в выявлении этого комплекса путем обработки его меченым анти-у-глобулином.

Обнаружение иммуноглобулинов иммунофлуоресцентным ме­тодом возможно, если антиген, использованный iп vitro для обра­зования антител, представляет собой растворимый белок. В этом случае он может быть конъюгирован с флуорохромом и В таком виде использоваться для обнаружения гомологичных антител.

Иммуноферментный анализ (ИФА). В основу метода положена конъюгация антитела или гаптена с Ферментом, которая не приводит к утрате антителом или гаптеном специфич­ности, а ферментом - каталитической активности. Однако в соста­ве комплекса антиген - антитело конъюгаты гаптен - фермент или антитело - фермент теряют свою каталитическую активность.

Соединение молекул антигена с ферментом осуществляется с помощью глутаральдегида - бифункционального реагента, взаи­модействующего с Е-аминогруппами белковых молекул. В каче­стве фермента успешно применяют в зависимости от модифика­ции метода либо пероксидазу, l3-галактозидазу, щелочную и кис­лую фосфатазы (реже ацетилхолин, глюкоамилазу), либо лизоцим, глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназу и малатдегидрогеназу. Используемый для маркировки антител фермент не должен присутство­вать в исследуемых клетках, содержащих антиген.

Иммуноферментные методы первоначально были разработаны для гистохимических исследований. Принцип иммуногистохими­ческого анализа с использованием ферментов заключается в сле­дующем. Антитела, маркированные ферментом, соединяются со специфическим антигеном, фиксированным на твердом носителе (полистироловая пластина или другие непористые полимеры), об­разуя невидимый комплекс. Выявление иммунных комплексов, содержащих фермент, проводится с помощью цветной реакции, происходящей при добавлении фермент-специфического субстра­та. Окрашенный комплекс антиген - антитело выявляется в све­товой или электронной микроскопии.

В дальнейшем методы иммуноферментного анализа стали при­менять для количественного определения антигенов и антител в биологических жидкостях. Были созданы гетерогенные (твердо­фазные) и гомогенные методы, принципиально отличающиеся способом разделения компонентов иммунохимической реакции. Гомогенный метод характеризуется протеканием реакции анти­ген - антитело в гомогенном растворе, и этап физического разде­ления реагентов и продуцентов реакции не обязателен. Твердо­фазные методы основаны на применении антител (или антиге­нов), иммобилизованных на нерастворимых носителях, гомоген­ные методы - на эффекте модуляции антителами активности фермента, связанного с антигеном. В основу гомогенных методов положен принцип конкурентного взаимодействия меченого и не­меченого гаптена с активными центрами антител. Чем больше свободного гаптена введено в реакцию до прибавления меченого гаптена, тем меньшее количество последнего будет связано с ан­тителами. Соответственно и ферментативная активность в раство­ре изменится незначительно. Наоборот, чем меньше свободного гаптена ввести в реакцию, тем большее количество ковалентного соединенного с ферментом гаптена уйдет в иммунный комплекс, а ферментативная активность в растворе существенно понизится.

Определение неизвестной концентрации гаптена в образце осу­ществляют по заранее выведенной калибровочной кривой, для пост­роения которой устанавливают зависимость активности фермента в данной системе от стандартных концентраций свободного гаптена.

В твердофазном иммуноферментном анализе наряду с конку­рентными методами распространены подходы, основанные на последовательном взаимодействии фиксированных на носителе иммуноглобулинов с антигеном (или наоборот), а затем с имму­ноферментным конъюгатом, представляющим собой меченные ферментом антитела против иммуноглобулинов (сэндвич-метод, от англ. sandwich - бутерброд).

Радиоиммунологический анализ (РИА). В ра­диоиммунологическом анализе специфичность реакции антиген- антитело сочетается с высокой чувствительностью, обеспечивае­мой применением радиоактивной метки, благодаря которой мож­но определить количество азота антител до 1х10-8 мг/мл. Для проведения анализа необходимо иметь антисыворотки и гомо­логичные антигены, маркированные каким-либо изотопом йода (125j, 131j), равно как и гаптены, маркированные 14С или 3Н. Чув­ствительность метода существенно возрастает при использовании высокоаффинных антител с низкой перекрестной реактивностью и антигенов с высокой удельной радиоактивностью. В основу ра­диоиммунологического анализа положен принцип конкурентного взаимодействия определяемого немеченого антигена и известного количества меченого антигена с активными центрами антител. При этом происходит вытеснение меченого антигена или гаптена из его комплекса с антителом вследствие последующего добавле­ния больших концентраций немеченого антигена или гаптена той же специфичности. Реакция (при высоком разведении ингредиен­тов) подчиняется закону действующих масс: происходящее вытес­нение пропорционально введенному количеству не меченого ан­тигена или гаптена. Конкуренцию между определяемым и мече­ным антигенами можно оценить количественно с помощью ра­диометрии, предварительно отделив образовавшиеся иммунные комплексы от несвязавшегося меченого антигена. Концентрацию определяемого антигена рассчитывают, исходя из сравнения соот­ношений свободного и связанного меченых реагентов с соответ­ствующим стандартом.