Александра Хенао-Диаза (Alexandra Henao-Diaza)⁎, Джу Джиb (Ju Jib), Луис Хименес-Лиролаа (Luis Gimenez-Lirolaa), Дэвид Х. Баума (David H. Bauma), Джефри Циммермана (Jeffrey Zimmermana).
аОтдел ветеринарной диагностики и медицины продуктивных животных, Университет штата Айова, г. Амес, США (Department of Veterinary Diagnostic and Production Animal Medicine, College of Veterinary Medicine, Iowa State University, Ames, IA 50011. USA)
bОтдел статистики колледжа искусств и науки, Университет штата Айова, США (Department of Statistics, College of Liberal Arts and Sciences, Iowa State University, Ames, IA, 50011. USA)
Информация о статье:
Ключевые слова: Diagnostic transition stages, Disease transition stages, ELISA, Meta-analysis, PRRSV, RT-PCR
Краткое содержание:
В статье рассмотрены вопросы, связанные с эффективностью диагностики персистирующих инфекций. На примере РРСС обсуждается взаимосвязь между «стадиями заболевания» и «стадиями диагностики» на основе мета-анализа данных результатов диагностических исследований (n = 4307 результатов), представленных в реферированных научных работах для понимания ключевых моментов. Несмотря на продолжающееся усовершенствование методов диагностики ни один из них по отдельности не может быть признан единственно правильным решением: выбор типа образца и теста для исследования зависит от конкретной поставленной задачи. В большинстве случаев, для установления истинной картины эпизоотии, необходимо использовать несколько методов исследования и/или типов образцов.
Сокращения: ДПЗ – дней после заражения; ELISA - твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА); ВЯ – вирус ящура; ПЦР – полимеразная цепная реакция; ВРРСС – вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней; РТ-ПЦР – полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией
1. Вступление, методы и результаты
Для заболеваний, вызванных патогенами, не приводящими к проявлению явно выраженных клинических признаков, как, к примеру, при заражении вирусом репродуктивно-респираторного синдрома свиней (ВРРСС), выявление и/или дифференциальная диагностика должна основываться на лабораторных исследованиях.
В связи с этой необходимостью после выделения ВРРСС в 1991 году и обнаружения линий клеток, способных поддерживать репликацию вируса, были разработаны использующиеся до настоящего времени методы диагностики (Zimmerman and Yoon, 2003). Поколение современных инструментов диагностики, таких как полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (РТ-ПЦР) для детекции РНК ВРРСС и твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) для детекции ВРРСС-специфичных антител за последние 30 лет прошли долгий путь технологических усовершенствований. Оба метода обладают достаточной диагностической эффективностью и, при правильном применении, составляют основу при осуществлении программ по предотвращению, контролю и ликвидации ВРРСС (Trevisan et al., 2019).
Однако и спустя 30 лет после обнаружения, ВРРСС по-прежнему распространён по всему миру и наносит существенный экономический ущерб – ежегодные потери в некоторых неблагополучных хозяйствах могут достигать €650 на свиноматку (~$722) (Nathueset al., 2017).
Почему же, несмотря на возможности современных методов диагностики, программы по контролю и ликвидации ВРРСС до сих пор сталкиваются со многими сложностями? Есть два основных типа вирусных инфекций – острые и персистирующие. Острые инфекции, такие как вирус гриппа А стимулируют иммунный ответ организма хозяина, в результате чего вирус быстро и эффективно выводится из организма. Напротив, если иммунный ответ недостаточный или неэффективный, то инфекция становится персистирующей. Персистирующие инфекции можно разделить на подтипы: латентные, вялотекущие или хронические (MacLachlan and Dubovi,2017). При латентном течении вирус крайне сложно определить в организме хозяина (без принятия экстремальных мер), но при активизации вируса происходит его дальнейшая репликация и выделение в окружающую среду – как, например, это характерно для вируса болезни Ауески. При вялотекущих инфекциях обычно наблюдается длительная субклиническая фаза, во время которой происходит репликация вируса, что в итоге приводит к проявлению клинических признаков, как происходит, например, при прогрессирующей пневмонии овец. Хронические персистирующие инфекции – как в случае ВРРСС – характеризуются продолжающейся репликацией вируса и постепенным избавлением от вируса под воздействием иммунной системы.
В случае ВРРСС: 1) инфекция приводит к развитию виремии с пиком примерно на 7-е сутки после инфицирования и сопровождается появлением не нейтрализующих антител (Kittawornrat et al., 2010); 2) Окончание виремии совпадает с появлением нейтрализующих антител (Loving et al., 2015); 3) репликация вируса происходит в лимфоидных тканях (Horter et al., 2002; Molina, 2008; Wills et al., 1997, 2003); 4) в итоге происходит выведение вируса из организма свиньи. Wills et al.,(1997) сообщали об изоляции ВРРСС из глоточных образцов (соскоб с миндалин) у свиней, содержавшихся в индивидуальных станках до 157 суток после заражения (Wills et al., 1997).
Рисунок 1. Последовательность реакций на заражение свиньи вирусом РРСС. Репринт из статьи «Роль нейтрализующих антител в развитии протективного иммунитета против ВРРСС» в журнале «Veterinary Immunology and Immunopathology», 102/3, (Lopez and Osorio, Role of neutralizing antibodies in PRRSV protective immunity, p. 156., Copyright (2004), с разрешения Elsevier. Лицензия 4753121290293).
Таблица 1. Прогностические уравнения для расчёта вероятности определения ВРРСС разными диагностическими методами (обобщенные данные) (n = 4307) из 19 научных статей (1995–2018)a.
a Данные индивидуальной диагностики ВРРСС, полученные Allende et al., 2000; Christopher-Hennings et al., 1995, 1998, 2001; Henao-Diaz et al., 2018; Horter et al., 2002; Kittawornrat et al., 2010, 2013; Molina, 2008; Molina et al., 2008; Pepin et al., 2015; Prickett et al., 2008; Reicks et al., 2006; Rovira et al., 2007; Rowland et al., 2003; Sattler et al., 2014; Wasilk et al., 2004; Wills et al., 1997, 2003.
b Уравнения логистической регрессии, основанные на данных мета-анализа (V 9.4 SAS®, SAS Institute Inc., Cary, NC) получены с использованием трёх баз данных с результатам индивидуальной диагностики (n = 4307).
c Детекция инфекционного ВРРСС в биопробе, то есть заражение здоровых животных гомогенатом лимфоидных тканей или изоляция вируса в культуре клеток. Данные биопробы (n = 468) включённые в настоящий анализ представляют собой индивидуальные образцы, отобранные на ≥7-е сутки после заражения ВРРСС.
d тестирование ИФА проводилось с использованием IDEXX ELISA HerdCheck® или IDEXX PRRS ELISA X3 Ab Test (IDEXX Laboratories, Inc., Westbrook, ME, USA). Данные полученные в ELISA (n = 1866) и включённые в настоящий анализ представляют собой индивидуальные образцы проб, взятых на ≥14-е сутки после заражения свиней ВРРСС.
Рисунок 2. Уровни выявления ВРРСС, прогнозируемые в соответствии с уравнениями, приведёнными в Таблице 1. Графики демонстрируют прогнозируемый уровень выявления РНК ВРРСС в сыворотке методом РТ-ПЦР (стадия виремии), выделения инфекционного ВРРСС в лимфоидных тканях методом биопробы (инфицированные свиньи) и выделения антител к ВРРСС методом ИФА (ранее был контакт с вирусом). Область между графиками для РТ-ПЦР и биопробы представляет прогностическую вероятность выявления свиней без виремии, но которые могут являться носителями инфекционного вируса.
Lopez and Osorio (2004) описали весь процесс инфекции ВРРСС во времени (Рисунок 1), но в их работе не рассматривалась значимость лабораторных исследований. Чтобы заполнить этот пробел был проведён мета-анализ, с соответствующим логистическим регрессионным анализом (V 9.4 SAS®, SAS Institute Inc., Cary, NC) на основе данных научных статей (n = 19; с 1995 по 2018 гг.), в которых сообщалось о выделении ВРРСС в разное время после заражения у отдельных животных (Allende et al., 2000; Christopher-Hennings et al., 1995, 1998, 2001; Henao-Diaz et al., 2018; Horter et al., 2002; Kittawornrat et al., 2010, 2013; Molina, 2008; Molina et al., 2008; Pepin et al., 2015; Prickett et al., 2008; Reicks et al., 2006; Rovira et al., 2007; Rowland et al.,2003; Sattler et al., 2014; Wasilk et al., 2004; Wills et al., 1997, 2003).
В целом, база данных содержала 4307 продолжительных наблюдений связанных с выделением ВРРСС с использованием трёх подходов:
РНК в сыворотке (РТ-ПЦР), инфекционный вирус в лимфоидных тканях (биопроба) и антитела в сыворотке крови (ИФА). Для данного анализа применялась обобщённая смешанная модель с логит-связью и с использованием “PROC GLIMMIX” (V 9.4 SAS®). Результаты тестирования закладывались как «негативные» 0, «позитивные» 1; дни после заражения (ДПЗ) – рассматривались как независимая переменная; источник диагностических данных (1 - 19 научная статья) – рассматривался как случайный эффект. Предполагаемые отрезки времени переменной ДПЗ использовалось при составлении трёх уравнений логистической регрессии для прогноза выявления ВРРСС во времени тремя изучаемыми методами (Таблица 1). На Рисунке 2 показан прогноз уровня выявления ВРРСС по трём уравнениям в период до 250-го дня после заражения.
Стоит отметить, что уровень выявления ВРРСС существенно зависел от типа образца для тестирования (сыворотка или лимфоидные ткани) и диагностического метода (РТ-ПЦР, биопроба или ELISA). К примеру, на 98-й ДПЗ по прогнозу следовало, что <2% свиней будут на стадии виремии, при этом у 30% вирус будет находиться в лимфоидных тканях, и > 90% свиней будут позитивны по антителам к ВРРСС. Прогностические уровни выделения ВРРСС в зависимости от ДПЗ представлены в Таблице 2.
Таблица 2. Прогностический уровень a ВРРСС-позитивных животных для разных диагностических методов во времени.
• Не тестировалось.
a Уровни детекции ВРРСС полученные из прогностических уравнений (Таблица 1) на основании обобщенных данных (n = 4307) из 19 научных статей (1995–2018).
b Постановка биопробы: заражение здоровых животных гомогенатом лимфоидных тканей или изоляция вируса в культуре клеток. Данные биопробы представляют собой индивидуальные образцы, отобранные на ≥7-е сутки после заражения ВРРСС.
c тестирование ELISA проводилось в IDEXX ELISA HerdCheck® или IDEXX PRRS ELISA X3 Ab Test (IDEXX Laboratories, Inc., Westbrook, ME, USA). Данные ELISA представляют собой индивидуальные образцы проб, взятых на ≥14-е сутки после инфицирования свиней ВРРСC.
2. Обсуждение
При классическом подходе «естественная история» инфекционного заболевания подразумевает «стадии заболевания», которые организм проходит во время инфекции. (Thurmond, 2003). В своё время Lopez and Osorio (2004) описывали стадии течения РРСС следующим образом: виремия, иммунный ответ, секвестрация вируса в лимфоидных тканях и конечная элиминация вируса из организма свиньи (Рисунок. 1). Thurmond (2003) на примере ящура, ввёл понятие «диагностические стадии» для описания изменений в чувствительности и специфичности в зависимости от типа исследуемого образца и диагностического метода на разны стадиях заболевания ящуром. В случае с ящуром образцы сыворотки крови свиней могут использоваться для выделения ДНК этого вируса, если сыворотка получена до исчезновения признаков виремии (≤ 10 ДПЗ), но при этом инфекционный вирус по-прежнему присутствует в миндалинах мягкого нёба и других тканях до 28-го дня после инфицирования (Poonsuk et al., 2018). Thurmond (2003) заключил в своей работе, что для достоверного определения вируса следует хорошо понимать заболевание как таковое и стадии, наиболее подходящие для диагностики тем или иным методом, особенно в случае персистирующих инфекций, таких как РРСС, ящур, КЧС, болезнь Ауески (Beran et al., 1980; Panyasing et al., 2018).
Заболевание, вызванное ВРРСС и его диагностические стадии частично представлены во многих независимых исследованиях: (Allende et al., 2000; Christopher-Hennings et al., 1995, 1998, 2001; Henao-Diaz et al., 2018; Horter et al., 2002; Kittawornrat et al., 2010, 2013; Molina, 2008; Molina et al., 2008; Pepin et al., 2015; Prickett et al., 2008; Reicks et al., 2006; Rovira et al., 2007; Rowland et al., 2003; Sattler et al., 2014; Wasilk et al., 2004; Wills et al., 1997, 2003).
Проведение обобщенного анализа данных этих исследований позволило более полно охарактеризовать диагностические стадии в отношении ВРРСС в период до 250-го дня после инфицирования для трёх диагностических методов исследования. При сопоставлении Рисунков 1 и 2 видно, что описанная в литературе «естественная история» протекания РРСС полностью соответствует результатам обобщенного анализа. Таким образом, в подтверждение общих соображений Thurmond's (2003) по поводу диагностических стадий, настоящее исследование показывает, что вероятность определения ВРРСС варьирует в зависимости от типа образца, метода исследования и времени от начала инфекции у животного.
Технологии диагностики заболеваний будут продолжать развиваться с усовершенствованием методов исследования и их адаптацией к новым типам образцов для исследований, но при этом все равно сохраняются ограничения в эффективности различных методов диагностики в рамках стадий эпизоотии.
В условиях производства оптимальным подходом будет тот, при котором используются разные типы образцов и методов без ущерба эффективности, в соответствии с поставленными задачами – будь то раннее выявление заболевания, оценка инфекционного статуса, постоянный мониторинг поголовья, эффективность вакцинации, групповой иммунитет т.д. Такой подход требует определённой квалификации и кругозора специалистов для правильного выбора типа образца и/или метода исследования. Сыворотка всегда останется ценным материалом для проведения диагностики, но также и объединённые образцы жидкостей, выделяемых при кастрации и купировании хвостов, слюна отдельного животного или группы свиней способны обеспечить высокую эффективность и вероятность выявления инфекции с наименьшими затратами.
Как показано на Рисунке 2, обнаружение нуклеиновых кислот и определение антител должны использоваться как дополняющие друг друга методы исследования при РРСС.
В данной статье авторы попытались осветить фундаментальные вопросы диагностики, их практическое применение и, конкретно, взаимосвязь между стадиями заболевания и диагностическими стадиями. Как показано на примере ВРРСС выбор образца и теста для диагностики определяет, насколько точно удастся выявить инфекцию.
Знания таких закономерностей необходимы при выборе методов исследований – например, РТ-ПЦР используется в острую фазу, а ИФА – для выявления свиней-носителей вне стадии виремии и/или для выявления ранее произошедшего контакта с вирусом (Wills et al., 2003).
Приведённая в статье информация будет полезна при интерпретации результатов диагностических исследований, использующихся для контроля ВРРСС – например, положительные результаты в ИФА и отрицательные результаты в РТ-ПЦР у одной и той же группы животных не являются диагностическим противоречием, если рассматривать подобные результаты в свете концепции диагностических стадий.
Одобрение комитета по этике и согласие на участие
Не применимо.
Согласие на публикацию
Не применимо.
Доступность данных и материалов
Данные использованные и проанализированные в данной работе доступны по запросу у авторов.
Финансирование
Александра Хенао-Диаз получила стипендию от CONACyT Mexico в рамках программы «Becas al Extranjero».
Вклад авторов
Александра Хенао-Диаз и Джефри Циммерман отвечали за концепцию и написание данной статьи. Александра Хенао-Диаз и Джу Джи занимались сбором и анализом. Луис Хименес-Лирола, Дэвид Х. Баум и Джефри Циммерман отвечали за критический анализ и редактирование данной рукописи. Все авторы дали своё согласие на публикацию настоящей версии статьи.
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в отношении финансовых вопросов, авторства и/или публикации данной статьи.
Соавтор статью Джефри Циммерман консультировался с компанией IDEXX Laboratories по вопросам, не являющихся предметом настоящей статьи. Консультирование было одобрено Университетом штата Айова (Iowa State University) в соответствии с политикой Отсутствия конфликта интересов.
Благодарности
Мы благодарим доктора Фернандо Осорио (Dr. Fernando Osorio) за предоставленный оригинальный график, опубликованный в 2004 году (Lopez and Osorio, 2004) представленный в данной статье в виде Рисунка 1. Репринт с разрешения издательства Elsevier, лицензия 4753121290293 от 20 января, 2020.
Информация об авторах
Александра Хенао-Диаз: аспирант, занимается эпидемиологией и диагностикой ВРРСС; Джу Джи степень Ph.D. по биостатистике в области инфекционных заболеваний животных; Луис Хименес-Лирола – адьюнкт-профессор в области инфекционных заболеваний и их диагностики; Дэвид Х. Баум возглавляет секцию серологических исследований в Ветеринарной диагностической лаборатории Университета штата Айова; Джефри Циммерман – профессор, сфера исследований – инфекционные заболевания свиней.
Данный материал напечатан при посредничестве компании IDEXX Laboratories Inc. и с разрешения авторов этой статьи. Все вопросы по этому материалу вы можете направлять в адрес официального дистрибьютора IDEXX - компанию ВЕРУМБИО по электронной почте: info@verumbio.com
Хотите получить скидку 5 % на продукцию компании IDEXX? Звоните по телефонам: +7 (800) 500 3585 или +7 (495) 120 7787 и назовите код скидки – ВЕРУМБИО321P
Акция действительна до 31марта 2021 года.
Скидки не суммируются.
