Патогенные и транскриптомные различия между вирусами репродуктивно-респираторного синдрома свиней разных линий у поросят

Репродуктивно-респираторный синдром свиней (РРСС), вызываемый одноцепочечным РНК-вирусом PRRSV (вирус РРСС), остается одним из самых экономически значимых заболеваний в глобальном свиноводстве. Вирус характеризуется высокой генетической изменчивостью и рекомбинационной активностью, что приводит к постоянному появлению новых вариантов. Настоящее исследование посвящено сравнительному анализу патогенности и транскриптомного ответа хозяина на три рекомбинантных штамма PRRSV-2 (GX-2428, линия 3; GX-3264, линия 1.8; GX-5430, линия 1.5), изолированных на юге Китая. Результаты демонстрируют существенные различия в клинических проявлениях, вирусной динамике, патологии и иммунном ответе, коррелирующие с геномными особенностями и линией вируса. Наиболее вирулентный штамм GX-2428 вызывал тяжелую лихорадку, потерю веса, длительную виремию и выраженные поражения легких, сопровождающиеся гипервоспалительным цитокиновым ответом и интенсивной активацией врожденных и адаптивных иммунных путей на уровне транскриптома. Штамм GX-3264 (линия 1.8) проявлял умеренную патогенность с быстрым началом выделения вируса, но менее выраженным повреждением тканей. Напротив, штамм GX-5430 (линия 1.5) оказался низкопатогенным, вызывая минимальные клинические симптомы и слабый системный воспалительный ответ. Примечательно, что несмотря на низкую вирулентность, GX-5430 индуцировал наибольшее количество изменений в транскриптоме легких, преимущественно подавляя ключевые противовирусные и иммунные пути (например, экспрессию интерферон-стимулируемых генов ISG15, IFIT3, RSAD2), в то время как активируя метаболические и сигнальные пути (Wnt, PI3K-Akt), что указывает на стратегию уклонения от иммунного надзора. Все штаммы показали рекомбинационные события в области NSP2, причем вставки, гомологичные штамму NADC30, были общей чертой. Исследование подчеркивает критическую роль геномной рекомбинации, особенно в области NSP2, в модуляции вирулентности, и доказывает, что разные линии PRRSV используют различные стратегии взаимодействия с хозяином, что имеет важное значение для разработки мер контроля и диагностики.

Введение

Репродуктивно-респираторный синдром свиней (РРСС) – высококонтагиозное вирусное заболевание, наносящее колоссальный экономический ущерб свиноводству во всем мире. Клиническая картина включает репродуктивные нарушения (аборты, мертворождения, слабый помет) у свиноматок и респираторные заболевания у поросят и подсвинков. Возбудитель – вирус РРСС (PRRSV) – относится к семейству Arteriviridae, роду Betaarterivirus. Это оболочечный вирус с одноцепочечной РНК положительной полярности размером около 15 т.п.н., кодирующий как минимум 16 неструктурных (NSP) и 8 структурных белков. Вирус разделен на два генотипа: PRRSV-1 (европейский) и PRRSV-2 (североамериканский), гомология между которыми составляет около 60%. На территории Китая и многих стран Азии доминирует генотип 2, внутри которого на основе филогенетического анализа гена ORF5 выделяют множество линий (1-9).

Эпидемиологическая ситуация осложняется высокой скоростью мутаций и частой рекомбинацией между циркулирующими штаммами. После появления высокопатогенного PRRSV (HP-PRRSV, линия 8) в Китае в 2006 году, в последующие годы широкое распространение получили штаммы линии 3 (например, QYYZ), рекомбинантные штаммы, подобные NADC30 (линия 1.8), и NADC34-подобные вирусы (линия 1.5). Эти новые варианты демонстрируют разнообразные паттерны вирулентности, тканевого тропизма и способности уклоняться от иммунитета, что создает серьезные проблемы для существующих вакцин и стратегий биозащиты.

Традиционные методы изучения патогенеза (гистопатология, ПЦР, ИФА) позволяют оценить отдельные аспекты инфекции. Однако для понимания комплексных взаимодействий вируса и хозяина необходим системный подход. Секвенирование транскриптома (RNA-Seq) представляет собой мощный инструмент для глобального анализа экспрессии генов, позволяющий выявить ключевые клеточные пути, вовлеченные в иммунный ответ, повреждение тканей и механизмы вирусной персистенции. Разные штаммы PRRSV могут принципиально по-разному модулировать транскриптом клетки-хозяина: некоторые (часто низковирулентные) индуцируют ранний интерфероновый ответ, тогда как высоковирулентные штаммы могут его подавлять, одновременно вызывая дисрегуляцию воспаления.

Цель данного исследования – охарактеризовать патогенные свойства трех рекомбинантных штаммов PRRSV-2, принадлежащих к разным линиям (3, 1.8 и 1.5), в эксперименте на SPF-поросятах, и с помощью полногеномного транскриптомного анализа раскрыть молекулярные основы наблюдаемых различий в вирулентности и иммуномодуляции.

Материалы и методы

1. Выделение и идентификация вирусов. Образцы легких и сыворотки от свиней с подозрением на РРСС были собраны в провинции Гуанси (Китай) в 2024 г. Суспензию тканей, очищенную фильтрацией, инокулировали в культуру легочных альвеолярных макрофагов свиньи (PAMs). Репликацию вируса подтверждали по цитопатическому эффекту (ЦПЭ) и методом непрямой иммунофлуоресценции (НИФ) с использованием антител к нуклеокапсидному белку (N) PRRSV. В результате были выделены три штамма: GX-2428, GX-3264 и GX-5430.

2. Геномный и рекомбинационный анализ. Полные геномы вирусов 3-го пассажа были секвенированы методом Sanger. Филогенетический анализ по гену ORF5 проводили в программе MEGA 7. События рекомбинации выявляли с помощью программного пакета RDP4 и подтверждали методом симуляционного картирования (SimPlot).

3. Оценка патогенности на поросятах. Двадцать 5-недельных SPF-поросят, свободных от основных патогенов, были разделены на 4 группы (n=5): три экспериментальные (заражение штаммами GX-2428, GX-3264, GX-5430) и одна контрольная (среда). Заражение проводили интраназально и внутримышечно общей дозой 4×10⁵ ТЦД₅₀. В течение 21 дня наблюдения (dpi) ежедневно измеряли ректальную температуру, на 0, 7, 14, 21 dpi взвешивали животных. На 0, 3, 5, 7, 10, 14, 21 dpi собирали сыворотку, назальные и ректальные мазки. Вирусную РНК количественно определяли ОТ-ПЦР в реальном времени, нацеленной на ген ORF6. Уровень антител к N-белку определяли коммерческим ИФА.

4. Патологоанатомическое и гистологическое исследование. На 21 dpi всех поросят подвергали эвтаназии и проводили вскрытие. Оценивали макроскопические изменения легких. Образцы легких и лимфоидных органов фиксировали в формалине, готовили гистологические срезы и окрашивали гематоксилином и эозином. Для обнаружения вирусного антигена в тканях проводили иммуногистохимическое окрашивание (ИГХ) антителами к белку N PRRSV. Вирусную нагрузку в различных тканях определяли методом ОТ-ПЦР.

5. Измерение цитокинов. Уровни цитокинов IL-1β, IL-4, IL-10 и TNF-α в сыворотке крови на 0, 3, 5, 7, 10, 14, 21 dpi определяли с помощью коммерческих наборов для ИФА.

6. Транскриптомный анализ (RNA-Seq). Тотальную РНК выделяли из тканей легких, взятых на 21 dpi. Библиотеки кДНК готовили и секвенировали на платформе Illumina. Чтения картировали на референсный геном свиньи (Sus scrofa). Дифференциально экспрессируемые гены (ДЭГ) выявляли, используя критерии |log2FoldChange| ≥ 1 и скорректированное p-value (FDR) < 0.05. Функциональный анализ ДЭГ проводили с помощью обогащения терминами Gene Ontology (GO) и путями базы данных KEGG. Экспрессию отдельных ключевых генов валидировали методом количественной ПЦР в реальном времени (qRT-PCR).

7. Статистический анализ. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. Статистическую значимость различий между группами оценивали с помощью одно- или двухфакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим тестом Тьюки. Уровень значимости устанавливали на p < 0.05.

Результаты

1. Геномная характеристика изолятов. Полногеномное секвенирование показало, что GX-2428, GX-3264 и GX-5430 имеют длину 14 993, 15 013 и 15 019 н. соответственно. Филогенетический анализ по ORF5 отнес штаммы к линиям 3, 1.8 и 1.5 соответственно. Анализ рекомбинации выявил, что все три штамма являются результатом множественных межлинейных рекомбинационных событий. Критически важным оказался участок NSP2, который у всех изолятов частично или полностью был замещен последовательностью, гомологичной штамму NADC30 (линия 1.8). Дополнительные точки рекомбинации были обнаружены в NSP1, NSP9, NSP12 и в генах структурных белков (ORF2-ORF4). Так, GX-2428 (линия 3) оказался сложным рекомбинантом между предковыми штаммами, подобными JXA1 (линия 8, основная родительская последовательность в ORF1), NADC30 (линия 1.8, донор для NSP2), QYYZ (линия 3, донор для части структурных генов) и VR-2332 (линия 5).

2. Клинические проявления и динамика веса. Поросята, зараженные штаммами GX-2428 и GX-3264, демонстрировали выраженную гипертермию (>40.5 °C), пик которой пришелся на 5-7 dpi. В группе GX-5430 температура оставалась в пределах нормы и не отличалась от контроля. Прирост живой массы за 21 день эксперимента был достоверно ниже в группах GX-2428 и GX-3264 по сравнению с контрольной группой (p<0.0001), тогда как в группе GX-5430 снижение веса было незначительным (p>0.05).

3. Вирусная динамика и гуморальный иммунный ответ. Виремия была обнаружена у всех инфицированных животных уже к 3 dpi. Однако ее динамика и длительность различались:

- GX-2428: Достигал пика виремии (10⁵·²⁷ копий/мл) к 10 dpi и сохранял определяемый уровень (10³·³⁷ копий/мл) до конца эксперимента (21 dpi).

- GX-3264 и GX-5430: Пик виремии был ниже (10⁴·²⁸ и 10³·⁴³ копий/мл соответственно), а к 21 dpi вирусная РНК в сыворотке не детектировалась.
Выделение вируса с назальными и фекальными секретами начиналось раньше всего в группе GX-3264 (3 dpi). Специфические антитела начинали появляться с 10-14 dpi и нарастали ко всем штаммам, без значимых межгрупповых различий в уровне.

4. Патологические изменения и распределение вируса в тканях. На 21 dpi у поросят, зараженных GX-2428 и GX-3264, наблюдались выраженные макроскопические признаки интерстициальной пневмонии: уплотнение легочной ткани, неспадение и геморрагические очаги. Гистологически выявлено утолщение альвеолярных перегородок, инфильтрация лимфоцитами и макрофагами, десквамация альвеолоцитов. Изменения были наиболее тяжелыми в группе GX-2428. В группе GX-5430 повреждения легких были минимальными. ИГХ подтвердило наличие вирусного антигена в альвеолярных макрофагах и эпителии инфицированных животных.
Анализ вирусной нагрузки в органах на 21 dpi показал различный тканевый тропизм:

- GX-2428: Максимальная нагрузка – в легких, затем в паховых лимфоузлах и миндалинах.

- GX-3264 и GX-5430: Максимальная нагрузка – в лимфоидных органах (миндалины, бронхиальные и паховые лимфоузлы), причем в легких она была значительно ниже, чем у GX-2428.

5. Цитокиновый профиль сыворотки. Оба более вирулентных штамма индуцировали значительный выброс провоспалительных цитокинов. Уровни IL-1β и TNF-α резко возрастали на 3-5 dpi, особенно в группе GX-2428. Концентрация иммуносупрессивного IL-10 также была значительно повышена у поросят, инфицированных GX-2428 и GX-3264, достигая пика на 5 и 3 dpi соответственно. В группе GX-5430 уровни всех исследуемых цитокинов оставались близкими к контрольным значениям, за исключением кратковременного слабого подъема IL-4.

6. Транскриптомный анализ легочной ткани (21 dpi).

- Количество дифференциально экспрессируемых генов (ДЭГ). Неожиданно, наибольшее количество ДЭГ по сравнению с контролем было индуцировано низковирулентным штаммом GX-5430 (6680 ДЭГ: 3339 ап- и 3341 даун-регулируемых). Штамм GX-2428 вызвал 4277 ДЭГ (2334 ап-, 1943 даун-), а GX-3264 – 3268 ДЭГ (2020 ап-, 1248 даун-). Анализ главных компонент (PCA) четко разделил все экспериментальные группы.

- Функциональный анализ (GO и KEGG) для высоковирулентных штаммов. Для GX-2428 и GX-3264 ДЭГ были значительно обогащены терминами и путями, связанными с иммунным ответом: «активация лимфоцитов», «цитотоксичность NK-клеток», «сигнальный путь B-клеточного рецептора», «взаимодействие цитокин-цитокиновый рецептор». Была отмечена мощная активация генов врожденного иммунитета: рецепторов распознавания (TLR), факторов транскрипции (IRF7, STAT1), интерферон-стимулируемых генов (ISG15, IFIT3, RSAD2, CXCL10).

- Функциональный анализ для низковирулентного штамма GX-5430. Несмотря на большее число ДЭГ, их обогащение иммунными путями было выражено слабее. Напротив, преобладали пути, связанные с метаболическим перепрограммированием, организацией внеклеточного матрикса, ангиогенезом и передачей сигналов (Wnt, PI3K-Akt, MAPK). Критическим отличием было глобальное подавление ключевых противовирусных эффекторов: ISG15, IFIT3, RSAD2, MX1, OAS1. Одновременно отмечалась повышенная экспрессия негативных регуляторов воспаления, таких как TNFAIP3 (A20) и NFKBIA (IκBα), которые ингибируют сигнальный путь NF-κB.

Обсуждение

Настоящее исследование предоставляет всестороннюю сравнительную характеристику патогенности и молекулярного взаимодействия с хозяином трех рекомбинантных штаммов PRRSV, представляющих эпидемиологически значимые линии (3, 1.8 и 1.5), циркулирующие в Китае.

1. Рекомбинация как драйвер разнообразия и вирулентности. Выявленные сложные рекомбинационные паттерны подтверждают, что рекомбинация является ключевым механизмом эволюции PRRSV-2 в полевых условиях. Общим знаменателем для всех трех штаммов стала рекомбинация в области гена NSP2 с участием последовательности, гомологичной штамму NADC30 (линия 1.8). Белок NSP2 играет мультифункциональную роль в репликационном цикле, модуляции врожденного иммунного ответа и апоптоза. Замещение этого домена может существенно влиять на вирулентность и способность к персистенции. Наблюдаемая конвергентная эволюция в сторону включения фрагментов NADC30 в NSP2 может указывать на селективное преимущество таких рекомбинантов, возможно, связанное с улучшенным уклонением от иммунного ответа.

2. Стратегии вирулентности: гипервоспаление vs. иммуносупрессия. Исследование четко демонстрирует две различные патогенетические стратегии:

- Высоковирулентные штаммы (GX-2428, линия 3; GX-3264, линия 1.8): Их патогенез тесно связан с индукцией чрезмерного и, вероятно, дисрегулированного системного воспаления («цитокиновый шторм»), о чем свидетельствуют высокая лихорадка, выброс IL-1β, TNF-α и IL-10, а также массовая активация провоспалительных и иммунных путей в легких на уровне транскриптома. Этот каскад, направленный на ограничение вируса, приводит к иммунопатологическому повреждению легочной ткани, что является основной причиной тяжелых респираторных симптомов. Длительная виремия GX-2428, несмотря на мощный иммунный ответ, предполагает наличие у этого штамма особых механизмов резистентности к нейтрализации или нарушению клиренса.

- Низковирулентный штамм (GX-5430, линия 1.5): Его стратегия противоположна. GX-5430 вызывает минимальное системное воспаление, что коррелирует с отсутствием клинических признаков. Однако транскриптомные данные раскрывают активное вмешательство вируса в работу клетки. Глобальное подавление ключевых ISG и повышение экспрессии ингибиторов NF-κB-пути (TNFAIP3, NFKBIA) указывает на эффективную супрессию противовирусного состояния клетки. Это позволяет вирусу реплицироваться, не вызывая яркого иммунного ответа, и способствует персистенции, что подтверждается высокой вирусной нагрузкой в лимфоидных органах даже при отсутствии виремии на поздних сроках. Большое количество ДЭГ, обогащенных метаболическими и сигнальными путями, может отражать глубокое перепрограммирование клеточного метаболизма для нужд вирусной репликации.

3. Дивергенция тканевого тропизма. Различия в распределении вируса по органам (легкие vs. лимфоидная ткань) между штаммами имеют важное эпидемиологическое значение. Способность GX-3264 и GX-5430 к длительной персистенции в миндалинах и лимфоузлах, даже после исчезновения из крови, создает резервуар для скрытого вирусоносительства и потенциальной передачи, что осложняет контроль и эрадикацию болезни в стаде.

4. Практическая значимость. Полученные данные подчеркивают:

- Необходимость дифференцированной диагностики: Для оценки рисков в стаде недостаточно детектировать только факт наличия PRRSV. Определение линии и, по возможности, рекомбинационного паттерна (особенно в NSP2) может дать информацию о потенциальной вирулентности изолята.

- Важность мониторинга лимфоидных органов: Отрицательный результат ПЦР в крови не исключает наличия персистирующей инфекции в тканях.

- Вызов для вакцинологии: Существующие вакцины, разработанные против одних линий, могут в разной степени защищать от других, учитывая принципиально разные стратегии иммуномодуляции, продемонстрированные в работе.

Заключение

В результате исследования установлено, что штаммы PRRSV, принадлежащие к разным генетическим линиям, обладают выраженными различиями в патогенности, которые определяются их уникальными геномными особенностями (рекомбинация в NSP2) и способностью модулировать транскриптом хозяина. Высоковирулентные штаммы (линии 3 и 1.8) вызывают патологию преимущественно через индукцию гипервоспаления и иммунопатологии, в то время как низковирулентный штамм (линия 1.5) использует стратегию активного подавления противовирусного ответа и персистенции в лимфоидных тканях. Эти фундаментальные различия должны учитываться при разработке стратегий диагностики, контроля и профилактики РРСС.


Исследование: Veterinary Research