Оральные жидкости: универсальный инструмент для эффективного анализа в стадах

Введение.

В связи с интенсивным развитием свиноводческой отрасли в России остро встает вопрос эффективной диагностики инфекционных заболеваний в хозяйствах. Классические методы, такие как бактериологические и серологические, хотя и не потеряли своей актуальности, но все же не всегда отвечают современным требованиям по чувствительности, специфичности, скорости получения результата и информативности.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) с детекциейв режиме реального времени зарекомендовала себя как быстрый и чувствительный метод, который применяется в большинстве свиноводческих хозяйств во всем мире. Он позволяет не только в минимальные сроки и с непревзойдённой чувствительностью выявлять возбудителей, но и в ряде случаев, проводить его количественную оценку и типирование.

Одним из определяющих этапов исследования методом ПЦР является способ отбора проб. Именно от него зависит достоверность и качество получаемых результатов. Компания LifeTechnologiesвалидировала и оптимизировала диагностическую систему для детекции наиболее экономически важных заболеваний свиней, включающую наборы для ПЦР и для выделения с самой высокой чувствительностью, а также систему для пробоотбора на основе оральных жидкостей. Это решение доказало свою экономическую эффективность и может применяться как в благополучных, так и неблагополучных хозяйствах, а также при разработке различных стратегий по контролю и искоренению заболеваний.

Отборпроб.

Обычный отбор образцов (крови и оральных смывов) связан с рядом сложностей и неудобств: он трудозатратен, является стрессом для животных, требует непосредственного контакта и фиксации животных, может выполняться только опытным персоналом. Из-за невысокого количества зараженных животных на ранней, самой важной для диагностики, стадии заболевания, требуется большое количество проб. Следовательно, отбор образцов происходит только в случае крайней необходимости, когда время уже, возможно, потеряно.

Альтернативным способом отбора оральных жидкостей является отбор с помощью хлопчатобумажных веревок (Рис.1).

Рис.1. Схема процесса отбора проб с помощью хлопчатобумажных веревок.

Этот метод основан на природном любопытстве свиней, стремящихся жевать все окружающие предметы. Веревка подвешивается над загоном так, чтобы свиньи могли дотянуться до нее. Время экспозиции, как правило, достаточное для того, чтобы все животные в загоне пожевали ее, 30 мин. Веревки вешаются из расчёта одна на 10-15 животных. При недостаточной активности свиней можно увеличить экспозицию, поменять время вывешивания (до обеда животные более активны) или пропитать веревку раствором сахара. Данную процедуру может выполнять тех. персонал даже с низкой квалификацией и без ветеринарных навыков.

После отбора веревка убирается в пакет, где с неё отбирают 6-7 мл впитанной оральной жидкости (для исследования необходимо поместить в пробирку 2 мл). Пробирка с образцом направляется на исследование в лабораторию с учетом соблюдения условия транспортировки материала (в течение одного дня при температуре +40С или в замороженном виде).

Таким образом, максимально быстро и с минимальными трудозатратами можно получить готовую для исследования пробу, которую не требуется объединять(при этом можно получать и индивидуальные образцы), что снижает риск ошибок и контаминации из-за «человеческого фактора»). Эту пробу можно исследовать сразу на несколько заболеваний методом ПЦР-РВ, а также для проведения серологических исследований, что снижает общую стоимость диагностики.

Данный метод может применяться для ранней диагностики заболевания (когда животное еще активно и не угнетено), для мониторинга инфекции в благополучном стаде (в этом случае анализ проводят с определенной временной периодичностью или в различных возрастных группах животных), для диагностики заболеваний при перемещении животных между загонами, стадами или хозяйствами.

Наборы компании LifeTechnologies для диагностики оральных жидкостей

Для диагностики всех болезней свиней с ПЦР системами производства LifeTechnologiesможет использоваться один универсальный набор для выделения нуклеиновых кислот на основе магнитных частицMagMAXTMPathogenRNA/DNAKit. Использование одного набора, как для оральных жидкостей, так и для других материалов, обеспечивает высокуювоспроизводимость и достоверность получаемых результатов. Использование одной выделенной пробы для диагностики сразу нескольких заболеваний ведет к снижению себестоимости выделения, а работа с набором для выделения на автоматической станции позволяет минимизировать влияние «человеческого фактора» на данном этапе исследования.

Наборы для диагностики оральных жидкостей валидированыдля детекции наиболее экономически важных заболеваний свиней (РРСС, ЦВС2, грипп свиней).

Тест-система для детекции вируса РРСС LSI Vet MAX™ PRRSV EU/NA является самой чувствительной на рынке. Набор уникален и позволяет, помимо выявления вируса, проводить его одновременное типирование (дифференциация американского и европейского серотипов) без необходимости в дорогостоящем и время затратном секвенировании.

Для подтверждения эффективности использования тест-системыдля оральных жидкостей, было проведено исследование с использованием 80 свиней (8 загонов по 10 животных). Еженедельно в течение 12 недель отбирали образцы крови, сыворотки и оральных жидкостей из каждого загона. При этом происходили обычные для хозяйства перемещения животных. При первичном исследовании, животные были негативны на РРСС (подтверждено ИФА и ПЦР-тестами). При повторном тестировании количество свиней, инфицированных РРСС, было следующим:

в 2-ух загонах было инфицировано 100% животных,

в 4-х загонах было инфицировано 50% животных,

в 2-ух загонах было инфицировано 20% животных.

В результате проведенного исследования, была показана возможность высокочувствительной детекции РРСС в ротовых жидкостях (Рис. 2), простота метода, отсутствие влияния на повседневную деятельность хозяйства. Данный способ контроля состояния животных позволяет определить происходит ли распространение заболевания и исключить его попадание в незараженные зоны при перемещениях свиней.


Рис.2 Результаты выявления вируса РРСС в пробах сыворотки, крови и оральных жидкостях.

Набор для выявления вируса гриппа свиней VetMAX™- Gold SIV Detection Kit является самым чувствительным на рынке благодаря уникальной системе детекции сразу нескольких консервативных участков генома вируса. Исследования, проведенные на животныхс выраженными острыми респираторными симптомами, показали высокий уровень корреляции с результатами «классических» серологических методов с минимальной разницей, обусловленной небольшим временем выделения вируса и наличием колостральных антител у некоторых животных.

Набор для выявления цирковируса свиней LSI VetMAX™ PorcineCircovirusType 2 является единственным набором для проведения количественного анализа. Это позволяет с высокой достоверностью определять корреляцию между наличием вируса и вызываемым им синдромом после отъемного мультисистемного истощения. При использовании для исследования оральных жидкостей, набор позволяет выявлять вирус с минимальной возможностью получения ложноотрицательных результатов.

Таким образом, система отбора проб на основе оральных жидкостей в комплексе с диагностическими наборами LifeTechnologies является универсальным, удобным и надежным инструментом для диагностики заболеваний как на ранней стадии, так в острой фазе инфекции.