Какие методы лабораторной диагностики я использую для диагностирования РРСС? Какой из методов я выберу в зависимости от ситуации? Как интерпретировать результат?
Доступные анализы
Схема выявления вируса и антител после контакта с РРСС: Данный график показывает изменения концентрации (ось Y) во времени (ось Х) различных аналитов, используемых при анализе. После контакта с РРСС вы обнаружите вирус в крови свиней (виремия), что обычно длится примерно от 2 до 4 недель, в зависимости от возраста и иммунного статуса свиней. Сероконверсия (обнаружение антител) обычно появляется в период 7-10 дней после контакта и длится несколько месяцев, затем животное становится серонегативным. Нейтрализация антител появляется в период от 4 до 6 недель после контакта (López и Osorio, 2004).
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
* Обнаруживает наличие определенной последовательности вирулентной нуклеиновой кислоты (РНК).
* Типы образцов: ткани, кровь, сыворотка, ротовые жидкости, и т.д.
Преимущества:
- Одновременное использование различных праймеров для выявления РРСС типа 1 (европейский) и типа 2 (североамериканский) в одном образце.
- Очень высокая чувствительность (может выявить малейшее количество вируса).
- Раннее выявление – острые формы заболевания должны быть положительными.
- Использование множества различных видов образцов (ткани, кровь, сыворотка, ротовые жидкости и т.д.).
- Умеренная стоимость:
- Зачастую можно объединить 5 образцов сыворотки и ткани для снижения стоимости и минимизации потери чувствительности.
- Часто не объединяют ротовые жидкости из-за ожидаемых высоких пороговых значений (пониженная концентрация вируса), что может привести к существенному снижению чувствительности.
Недостатки:
* Во избежание ложно негативных результатов лаборатории должны периодически обновлять праймеры.
* Необходимо обновлять праймеры как для РРСС типа 1, так и типа 2.
* Для дифференциации вакцинного и дикого вируса необходимо секвенирование.
Иммуноферментный анализ (ИФА)
* Обнаруживает наличие антител.
* Типы образцов: сыворотка и ротовые жидкости (для некоторых наборов).
Преимущества:
- Большинство наборов выявляют антитела как для РРСС типа 1, так и типа 2.
- Животные остаются положительными в течение нескольких месяцев (3-12).
- Могут использоваться при хроническом заболевании.
Недостатки:
- Выявление специфических антител и время выявления могут немного варьироваться в зависимости от доступных коммерческих наборов.
- Для того, чтобы животные стали серопозитивными требуется 7-10 дней.
- Невозможно определить разницу между материнскими антителами и контактными.
- Невозможно дифференцировать вакцинный и дикий вирус.
Иммуногистохимия (ИГХ)
* Выявляет наличие вирусного антигена
* Типы образцов: ткани
Преимущества:
- Выявляет вирус в месте поражения (хорошее доказательств причинно-следственной связи).
- Может выявить низкую, среднюю или высокую концентрацию вируса.
Недостатки:
- Необходимо предоставить корректный образец ткани.
- По сравнению с ПЦР для выявления необходимо большее количество вируса
- Оценивает только маленький образец ткани.
Генетическое секвенирование
* Секвенирует генетические нуклеиновые кислоты вируса (РНК).
* Типы образцов: ткани, кровь, сыворотка, ротовые жидкости и т.д.
Преимущества:
- Могут дифференцировать вакцинный и дикий вирус.
- Может помочь дифференцировать новый появившийся вирус от существующего или прошлых вирусов.
Недостатки:
- Дорогой.
- Обычно секвенирует только ORF5, т.е. 600 из примерно 15 000 основных пар.
- Образцы с высоким пороговым значением (> 34) сложнее секвенировать.
Таблица 1. Успешное секвенирование, основанное на методе расчета пороговых значений цикла ПЦР для РРСС из образца ротовых жидкостей. Таблица подготовлена Chris Rademacher и др. 2016.
Косвенная иммунофлюоресценция (ИФА)
* Выявляет наличие антител.
* Типы образцов: сыворотка.
Преимущества:
- Наравне с ПЦР может выступать в качестве подтверждающего теста для неожиданных положительных результатов ИФА.
Диаграмма показывает использование косвенной иммунофлюоресценции для подтверждения РРСС в образцах, неожиданно показавших положительный результат при анализе с помощью ИФА теста. Подозреваемый отрицательный образец, который при анализе ИФА дает негативный результат, считается отрицательным. Если образец неожиданно положительный, то можно провести подтверждающий тест с помощью косвенной иммунофлюоресценции. Если этот тест показывает положительный результат, то образец считается положительным. Если он отрицательный, можно считать, что это был ложно-положительный результат, а так как ПЦР также отрицателен, поэтому инфекция не подтверждается.
Недостатки:
- Невозможно для большого количества образцов.
- На результат влияет изолят вируса, использованный для анализа.
- Надежность в большой степени зависит от технических навыков.
Интерпретация результатов
ПЦР
Положительный – Вирус присутствует/циркулирует, что с высокой степени вероятности говорит о причинно-следственной связи, особенно при низких пороговых значениях и наличии клинических признаков. Недавняя вакцинация модифицированной живой вакциной может привести к положительным ПЦР результатам.
Отрицательный – отсутствие вируса или отрицательный результат при наличии вируса, если тестирование проводится по прошествии большого количества времени после заражения.
ИФА
Положительный – Материнские антитела или контакт в прошлом (обычно> 7-10 дней после контакта) с вакцинным или диким вирусом.
Отрицательный – отсутствие вируса или для выявления прошло слишком мало времени после инфицирования (обычно должно пройти 7-10 дней после контакта).
ИГХ
Положительный – вирус присутствует в месте поражения.
Отрицательный – отсутствие вируса либо отрицательный результат при наличии вируса, если тест проводится по прошествии большого количества времени после заражения.
Генетическое секвенирование
Вакцинный вирус – ожидаемая гомология - > 99%.
Дикий вирус – ожидаемая гомология снижается на 1-2% в год.
ИФА
Положительный - Материнские антитела или контакт в прошлом (обычно> 7-10 после контакта) с вакцинным или диким вирусом.
Негативный - отсутствие вируса или для выявления прошло слишком мало времени после инфицирования (обычно должно пройти 7-10 дней после контакта).
Сценарии
Аборты у свиноматок/свинок
* Абортированные плоды: Соберите 6-8 плодов и проведите общий ПЦР анализ. Только около 50% абортированных плодов будут ПЦР-положительными (поэтому необходимо провести анализ большого количества плодов), но у положительных образцов обнаружится высокая концентрация вируса, поэтому их можно объединять в группы по 10 для ПЦР анализа.
* Абортирующие свиноматки/свинки: Соберите сыворотку свиноматок/свинок, у которых недавно случился аборт (< 10 дней) для ПЦР анализа. Можно объединить в группы по 5. ИФА-анализ будет бесполезен, так как обычно для того, чтобы стать серопозитивными наивным свиноматкам/свинкам требуется 7-9 дней.
Репродуктивные проблемы у свиноматок/свинок
* Соберите 15-20 образцов от животных с репродуктивными проблемами и 15-20 от животных, у которых данные проблемы отсутствуют и протестируйте с помощью ПЦР (можно объединить 5-6 образцов) или ИФА (каждый по отдельности).
Слабые поросята при опоросе
* Можно собрать семейные ротовые жидкости от слабых поросят нескольких пометов и протестировать с помощью ПЦР.
* Можно собрать тестикулы (если кастрируются), хвосты, ткани языка (мертвые поросята) от поросят из различных пометов. Для тестирования можно объединять большое количество образцов.
* Соберите образцы сыворотки от 10 пораженных пометов отобрав 2-3 поросенка из помета и протестируйте с помощью ПЦР, объединив 5-6 поросят. Убедитесь, что поросята не вакцинировались против РРСС.
Поросята на доращивании с острыми клиническими признаками РРСС
* Соберите ротовые жидкости с 4-6 различных станков и протестируйте индивидуально с помощью ПЦР. Не объединяйте образцы для тестирования.
* Соберите 15-30 рандомных образцов сыворотки от поросят с клиническими признаками и протестируйте с помощью ПЦР. Для анализа можно объединить в группы по 5-6.
Поросята на доращивании с хроническими признаками РРСС
* Соберите ротовые жидкости с 4-6 различных станков и протестируйте индивидуально с помощью ПЦР. Не объединяйте образцы для тестирования. Можно также использовать ИФА-анализ.
* Соберите 30 рандомных образцов сыворотки от поросят с клиническими признаками и протестируйте с помощью ПЦР. Для анализа можно объединить в группы по 5-6. Для подтверждения контакта можно использовать индивидуальное тестирование образцов с помощью ИФА-анализа.
Доступные анализы
Схема выявления вируса и антител после контакта с РРСС: Данный график показывает изменения концентрации (ось Y) во времени (ось Х) различных аналитов, используемых при анализе. После контакта с РРСС вы обнаружите вирус в крови свиней (виремия), что обычно длится примерно от 2 до 4 недель, в зависимости от возраста и иммунного статуса свиней. Сероконверсия (обнаружение антител) обычно появляется в период 7-10 дней после контакта и длится несколько месяцев, затем животное становится серонегативным. Нейтрализация антител появляется в период от 4 до 6 недель после контакта (López и Osorio, 2004).
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
* Обнаруживает наличие определенной последовательности вирулентной нуклеиновой кислоты (РНК).
* Типы образцов: ткани, кровь, сыворотка, ротовые жидкости, и т.д.
Преимущества:
- Одновременное использование различных праймеров для выявления РРСС типа 1 (европейский) и типа 2 (североамериканский) в одном образце.
- Очень высокая чувствительность (может выявить малейшее количество вируса).
- Раннее выявление – острые формы заболевания должны быть положительными.
- Использование множества различных видов образцов (ткани, кровь, сыворотка, ротовые жидкости и т.д.).
- Умеренная стоимость:
- Зачастую можно объединить 5 образцов сыворотки и ткани для снижения стоимости и минимизации потери чувствительности.
- Часто не объединяют ротовые жидкости из-за ожидаемых высоких пороговых значений (пониженная концентрация вируса), что может привести к существенному снижению чувствительности.
Недостатки:
* Во избежание ложно негативных результатов лаборатории должны периодически обновлять праймеры.
* Необходимо обновлять праймеры как для РРСС типа 1, так и типа 2.
* Для дифференциации вакцинного и дикого вируса необходимо секвенирование.
Иммуноферментный анализ (ИФА)
* Обнаруживает наличие антител.
* Типы образцов: сыворотка и ротовые жидкости (для некоторых наборов).
Преимущества:
- Большинство наборов выявляют антитела как для РРСС типа 1, так и типа 2.
- Животные остаются положительными в течение нескольких месяцев (3-12).
- Могут использоваться при хроническом заболевании.
Недостатки:
- Выявление специфических антител и время выявления могут немного варьироваться в зависимости от доступных коммерческих наборов.
- Для того, чтобы животные стали серопозитивными требуется 7-10 дней.
- Невозможно определить разницу между материнскими антителами и контактными.
- Невозможно дифференцировать вакцинный и дикий вирус.
Иммуногистохимия (ИГХ)
* Выявляет наличие вирусного антигена
* Типы образцов: ткани
Преимущества:
- Выявляет вирус в месте поражения (хорошее доказательств причинно-следственной связи).
- Может выявить низкую, среднюю или высокую концентрацию вируса.
Недостатки:
- Необходимо предоставить корректный образец ткани.
- По сравнению с ПЦР для выявления необходимо большее количество вируса
- Оценивает только маленький образец ткани.
Генетическое секвенирование
* Секвенирует генетические нуклеиновые кислоты вируса (РНК).
* Типы образцов: ткани, кровь, сыворотка, ротовые жидкости и т.д.
Преимущества:
- Могут дифференцировать вакцинный и дикий вирус.
- Может помочь дифференцировать новый появившийся вирус от существующего или прошлых вирусов.
Недостатки:
- Дорогой.
- Обычно секвенирует только ORF5, т.е. 600 из примерно 15 000 основных пар.
- Образцы с высоким пороговым значением (> 34) сложнее секвенировать.
Таблица 1. Успешное секвенирование, основанное на методе расчета пороговых значений цикла ПЦР для РРСС из образца ротовых жидкостей. Таблица подготовлена Chris Rademacher и др. 2016.
Косвенная иммунофлюоресценция (ИФА)
* Выявляет наличие антител.
* Типы образцов: сыворотка.
Преимущества:
- Наравне с ПЦР может выступать в качестве подтверждающего теста для неожиданных положительных результатов ИФА.
Диаграмма показывает использование косвенной иммунофлюоресценции для подтверждения РРСС в образцах, неожиданно показавших положительный результат при анализе с помощью ИФА теста. Подозреваемый отрицательный образец, который при анализе ИФА дает негативный результат, считается отрицательным. Если образец неожиданно положительный, то можно провести подтверждающий тест с помощью косвенной иммунофлюоресценции. Если этот тест показывает положительный результат, то образец считается положительным. Если он отрицательный, можно считать, что это был ложно-положительный результат, а так как ПЦР также отрицателен, поэтому инфекция не подтверждается.
Недостатки:
- Невозможно для большого количества образцов.
- На результат влияет изолят вируса, использованный для анализа.
- Надежность в большой степени зависит от технических навыков.
Интерпретация результатов
ПЦР
Положительный – Вирус присутствует/циркулирует, что с высокой степени вероятности говорит о причинно-следственной связи, особенно при низких пороговых значениях и наличии клинических признаков. Недавняя вакцинация модифицированной живой вакциной может привести к положительным ПЦР результатам.
Отрицательный – отсутствие вируса или отрицательный результат при наличии вируса, если тестирование проводится по прошествии большого количества времени после заражения.
ИФА
Положительный – Материнские антитела или контакт в прошлом (обычно> 7-10 дней после контакта) с вакцинным или диким вирусом.
Отрицательный – отсутствие вируса или для выявления прошло слишком мало времени после инфицирования (обычно должно пройти 7-10 дней после контакта).
ИГХ
Положительный – вирус присутствует в месте поражения.
Отрицательный – отсутствие вируса либо отрицательный результат при наличии вируса, если тест проводится по прошествии большого количества времени после заражения.
Генетическое секвенирование
Вакцинный вирус – ожидаемая гомология - > 99%.
Дикий вирус – ожидаемая гомология снижается на 1-2% в год.
ИФА
Положительный - Материнские антитела или контакт в прошлом (обычно> 7-10 после контакта) с вакцинным или диким вирусом.
Негативный - отсутствие вируса или для выявления прошло слишком мало времени после инфицирования (обычно должно пройти 7-10 дней после контакта).
Сценарии
Аборты у свиноматок/свинок
* Абортированные плоды: Соберите 6-8 плодов и проведите общий ПЦР анализ. Только около 50% абортированных плодов будут ПЦР-положительными (поэтому необходимо провести анализ большого количества плодов), но у положительных образцов обнаружится высокая концентрация вируса, поэтому их можно объединять в группы по 10 для ПЦР анализа.
* Абортирующие свиноматки/свинки: Соберите сыворотку свиноматок/свинок, у которых недавно случился аборт (< 10 дней) для ПЦР анализа. Можно объединить в группы по 5. ИФА-анализ будет бесполезен, так как обычно для того, чтобы стать серопозитивными наивным свиноматкам/свинкам требуется 7-9 дней.
Репродуктивные проблемы у свиноматок/свинок
* Соберите 15-20 образцов от животных с репродуктивными проблемами и 15-20 от животных, у которых данные проблемы отсутствуют и протестируйте с помощью ПЦР (можно объединить 5-6 образцов) или ИФА (каждый по отдельности).
Слабые поросята при опоросе
* Можно собрать семейные ротовые жидкости от слабых поросят нескольких пометов и протестировать с помощью ПЦР.
* Можно собрать тестикулы (если кастрируются), хвосты, ткани языка (мертвые поросята) от поросят из различных пометов. Для тестирования можно объединять большое количество образцов.
* Соберите образцы сыворотки от 10 пораженных пометов отобрав 2-3 поросенка из помета и протестируйте с помощью ПЦР, объединив 5-6 поросят. Убедитесь, что поросята не вакцинировались против РРСС.
Поросята на доращивании с острыми клиническими признаками РРСС
* Соберите ротовые жидкости с 4-6 различных станков и протестируйте индивидуально с помощью ПЦР. Не объединяйте образцы для тестирования.
* Соберите 15-30 рандомных образцов сыворотки от поросят с клиническими признаками и протестируйте с помощью ПЦР. Для анализа можно объединить в группы по 5-6.
Поросята на доращивании с хроническими признаками РРСС
* Соберите ротовые жидкости с 4-6 различных станков и протестируйте индивидуально с помощью ПЦР. Не объединяйте образцы для тестирования. Можно также использовать ИФА-анализ.
* Соберите 30 рандомных образцов сыворотки от поросят с клиническими признаками и протестируйте с помощью ПЦР. Для анализа можно объединить в группы по 5-6. Для подтверждения контакта можно использовать индивидуальное тестирование образцов с помощью ИФА-анализа.
Автор: Alejandro Ramirez
Источник: pig333.ru
