Инфицирование вирусом эпидемической диареи свиней (ЭДС) вызывает диарею, рвоту, а также повышает уровень смертности среди поросят. Предполагается, что средством распространения вируса может быть зараженный корм. Цель данного исследования состоит в том, чтобы сравнить вероятность нейтрализации ЭДС в кормах, подверженных термальной и электронно-лучевой обработке, а также в кормах с добавками.
Вирус эпидемической диареи свиней является плеоморфным оболочечным РНК-содержащим вирусом, который можно классифицировать как коронавирус. Первое заражение вирусом было зафиксировано в 1978 г. во время вспышки диареи на свиноферме в Бельгии. У поросят заражение вирусом вызывало диарею, рвоту и высокую смертность. После первого упоминания о вирусе, аналогичные симптомы стали возникать на фермах в Канаде, Корее, Китае, Италии, Венгрии, во Вьетнаме и на Таиланде. Немаловажно отметить, что Китай и Вьетнам являются ведущими странами по производству свиней в Азии, однако вирус появился и там.
В США вирус впервые был зафиксирован в апреле 2013 г., распространив высокую смертность среди поросят более чем в 17 штатах. Существуют предположения, что ЭДС попадает в организм свиньи через зараженный корм. Хотя ранее проводились исследования, подтверждающие выживание вируса в кормах и кормовых компонентах, недостаточно внимания уделялось сравнению результатов разного рода обработки корма, особенно с точки зрения влияния обработки на нейтрализацию вируса.
В сфере кормовой промышленности, температура и время обработки различаются в зависимости от выбранного метода, среди которых гранулирование, вытопка жира, пастеризация и распылительная сушка. Вид обработки также влияет и на содержание влаги в кормах и ингредиентах. Взаимодействие температуры, времени и влагосодержания оказывают влияние на нейтрализацию вируса. Считается, что ингредиенты свиного происхождения с наибольшей вероятностью участвуют в распространении заболевания. При обработке этих ингредиентов, условия отличаются в зависимости от состава сырья.
В целом, Национальная Ассоциация Салотопа полагает, что для большинства систем вытопки жира подойдут температуры в пределах от 115°C до 145°C, а время обработки – 40-90 мин. Эти температуры показали свою эффективность при нейтрализации таких возбудителей, как сальмонелла. А, к примеру, оболочечный РНК-содержащий вирус классической свиной лихорадки легко нейтрализовать путем обработки длительностью всего 1 мин. при температуре 71°C. Высокие температуры (около 100°C) используются также и в других видах обработки, включая тонкое измельчение во время приготовления злаковых зерен. Применение высоких температур при обработке продуктов и злаковых зерен может оказаться эффективным методом борьбы с вирусом ЭДС в зараженном корме, однако до настоящего момента не проводилось исследований, которые сравнивали бы выживаемость вируса при температурах выше 80°C.
Прочие виды обработки, такие как ионизирующее облучение, согласно исследованиям, снижают выживаемость возбудителей болезней в корме, в особенности это касается листерии моноцитогенес в птичьих кормах. Новые виды ионизирующего облучения, такие как электронный луч, в настоящее время используются для систематической пастеризации пищевых продуктов и очистки корма от возбудителей заболеваний. Ведущие характеристики лучевой технологии включают ее нетермальную природу (что снижает вероятность потери питательных веществ), применение коммерческой электроэнергии (то есть отсутствие зависимости от радиоактивных изотопов), высокая скорость обработки и возможность точного контроля применяемых доз. Американское управление по контролю за качеством пищевых продуктов и лекарственных препаратов (The US Food and Drug Administration) считает эту обработку приемлемой для пищевых продуктов и кормов в дозах, не превышающих 50 кГр. Благодаря всем этим характеристикам, лучевая технология может быть применена во многих сферах, включая пастеризацию животных кормов.
Помимо термальной и лучевой обработки, в прошлом также использовались определенные органические кислотные пищевые добавки, среди которых пропионовая, муравьиная и масляная кислоты, обладающие противомикробными характеристиками. Эти добавки использовали, чтобы контролировать такие возбудители заболеваний, как сальмонелла и кишечная палочка, которые преимущественно встречаются в птичьих кормах.
Тем не менее, эффект, производимый органическими кислотами и прочими добавками, включая сахар и соль, на корм, ранее не подвергался исследованию. Именно поэтому целью данной работы выступает попытка определить, являются ли термальные и нетермальные методы нейтрализации микробов, также как использование выборочных пищевых добавок, эффективными способами борьбы с вирусом ЭДС в зараженных кормах.
Материалы и методы
Вирус и его лечение
Национальная лаборатория медицинских услуг (г. Эймс, Айова) предложила штамм вируса ЭДС, который был размножен и титрован в клетки Vero-81 (из почки африканской зеленой мартышки). Согласно нашим наблюдениям, как клетки Vero-76, так и клетки Vero-81 чувствительны к вирусу ЭДС. В данном исследовании мы предпочли использование Vero-81. Клетки были выращены в Дульбекко среде Игла (DMEM, Херндон, Вирджиния, США) с содержанием 8% фетальной бычьей сыворотки (Gibco, Life Technologies, Гранд Айленд, Нью-Йорк, США), 50 мг/мл гентамицина (Mediatech), 150 мг/мл неомицина сульфата (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США), 1.5 мг/мл фунгизона (Sigma) и 455 мг/мл стрептомицина (Sigma). Клетки были трижды промыты фосфатно-буферным солевым раствором (pH 7.2). После внедрения вируса, клетки находились под воздействием температуры 37°C в течение 1 ч., что позволило поглотить вирус в поддерживающей среде (DMEM с гентамицином, неомицина сульфатом, фунгизоном, стрептомицином и 10 мг/мл трипсина). После внедрения клетки снова промывали в течение 60 минут. В качестве моющего средства, был применён сбалансированный соляной раствор Хэнка, не содержащий трипсин. Однако трипсин содержался в поддерживающей среде. Привитые клетки были инкубированы при температуре 37°C, под 5% CO2. Клетки находились под ежедневным наблюдением при помощи инвертационного микроскопа, чтобы не упустить появления цитопатического эффекта, вызываемого вирусом не позднее чем через пять дней после инфицирования.
Вирус был выведен для исследования путем проведения зараженных клеток через три цикла замерзания-отстаивания (-80°C/25°C) с последующим центрифугированием 2500 x g в течение 15 мин. при температуре 4°C. После была выделена надосадочная жидкость, которую распределили по пробиркам в 50 мл и поместили на хранение под низкой температурой (-80оС) до дальнейшего использования.
В рамках каждого эксперимента, выживший вирус был восстановлен в растворителе, содержащем 3% мясного экстракта (Lab Scientific, Хайлендс, Нью-Джерси) в 0.05 м глицина (Sigma, Сент-Луис, Миссури), pH 7.5. После десорбации, раствор был центрифугирован в течение 10 мин. при 2500 x g, чтобы избавиться от органических материй/веществ. Надосадочная жидкость использовалась, чтобы определить количество выжившего вируса. Для титрации вируса ЭДС в вирусном материале и других образцах, в монослои Vero-81, содержащиеся в 96-луночных панелях микротитратора (Nunc, Нью-Йорк, США), была внедрена серия десятикратных титров промывного раствора, заготовленного в среде DMEM (поддерживающая среда), с использованием 100 мл на лунку и трех лунок на титр.
Зараженные клетки развивались при температуре 37оС в атмосфере 5% CO2 сроком до семи дней, до появления цитопатического эффекта. Раствор, проявивший наибольший цитопатический эффект, считался конечной точкой. На основании титров вируса была высчитана средняя инфицирующая (цитопатическая) доза выращенной живой ткани (ЦПД50/мл) при помощи метода Кербера. Количество выжившего вируса было сопоставлено с первоначальным количеством вируса, чтобы вычислить, какой процент вируса удалось нейтрализовать, что отразилось на логарифмической шкале (лог10ЦПД50/мл).
Инактивация вируса ЭДС термальным способом
Учеными был получен свиной стартер (CGI, улучшенный NP-NT, партия №831458), который, как подтвердилось методом ОТ-ПЦР, не содержал вируса ЭДС. Последний анализ образца корма изображен в Таблице 1. Аликвоты корма (5 г) были подготовлены в аналитических стаканах, которые поместили в сушильные камеры при температурах 120, 130, 140 и 145оС. Аликвоты оставались в камерах в течение получаса, пока не приближались к заданной температуре. Как только корм достигал требуемой температуре, стаканы немедленно вынимали и добавляли в них 1 мл вируса ЭДС (6.8х103 ЦПД50/мл), который до этого соответствовал комнатной температуре (~25оС). После объединения стаканы поместили обратно в камеры в соответствующие температуры, где они культивировались в течение 0, 5, 10, 15, 20, 25 и 30 минут. После инкубационного периода образцы достали из камер и охлаждали вентилятором в течение 15 минут. Вирус элюировали из корма, используя 3%-ный раствор мясного экстракта, и число выживших частиц вируса было титровано. Для каждого титрования и внедрения в клетки были соединены по три образца каждой из температур, Эксперимент проводился только в двух экземплярах.
Инактивация вируса ЭДС лучевым способом
Чтобы вычислить равномерное дозирование образцов, были проведены предварительные эксперименты по картрированию доз. Число, определяющее равномерность доз, было высчитано с использованием максимальной и минимальной дозы для каждого эксперимента. При идеальных обстоятельствах, равномерная пропорция должна быть 1.0. В течение промышленной обработки животного корма при помощи лучевой технологии, размер конечного продукта следует оптимизировать, чтобы быть уверенными в равномерном дозировании. Оптимизация включает корректировку размеров и веса, чтобы обеспечить безопасное проникновение лучевых электронов, также как унифицированности доз в продуктах. В условиях промышленного производства, целью является попытка добиться максимально возможной однородности доз. На электронно-лучевом объекте на базе техасского университета A&M унифицированная пропорция промышленного животного корма составляет 1.78.
Аликвоты стартера для свиней (5 г) были помещены в несколько пластиковых центрифужных пробирок объемом 50 мл, с дальнейшим добавлением в каждую из пробирок 1 мл вируса ЭДС. После перемешивания, корм, отмеченный вирусом, был помещен в отдельные пластиковые контейнеры. Эти контейнеры были спрессованы, чтобы извлечь из них весь воздух и образовать тонкий, ровный слой образца. Контейнерф были трижды герметизованы, чтобы их можно было подвергать биобезопасным процедурам при помощи облучающей установки. За одну ночь контейнеры были перевезены в Государственный Центр Исследований Электронного Облучения в университете A&M в Техассе.
Для определения подходящей скорости конвейера и других параметров, требуемых для достижения необходимой дозы, были проведены предварительные испытания по доставке дозы. В день прибытия образцы были подвержены лучевым дозам в 10, 20, 30 и 50 кГр. Контрольный образец был привезен вместе с облученными образцами, однако он не подвергался облучению и по прибытию. После облучения, образцы (включая контрольные) отправили обратно в Университет штата Миннесота (Сейнт Пол) ночным рейсом. По прибытию, образцы немедленно элюировали с использованием вышеупомянутого раствора. Этот эксперимент проводили лишь однажды.
Влияние пищевых добавок на выживаемость вируса ЭДС в корме
Аликвоты корма в размере 5 г были помещены в пластиковые сцинтилляционные флаконы. Количество пищевых добавок, используемых в 5-граммовых образцах, было определено, исходя из рекомендованной дозировки производителей. В отдельные аликвоты корма были помещены следующие добавки: 0.015 г Ultracid P (Nutriad, Дендермонде, Бельгия), 0.02 г Activate DA (Novus International, Сейнт Чарльз, Миссури), 0.01 г Acid Booster (Agri-Nutrition, Дефорест, Висконсин), 0.01 г KEM-GEST (Kemin Agrifoods, Де-Мойн, Айова), 0.02 г гранулированного сахара (Shoppers Value, Иден-Прери, Миннесота) и 0.02 г промышленной соли (Essential Everyday, Эден-Прери, Миннесота).
Другой набор флаконов использовался как парные контрольные образцы без внедрения каких-либо добавок. После того, как добавки были помещены в требуемые флаконы, в каждый из них, независимо от наличия или отсутствия добавки, также поместили 1 мл вируса ЭДС и перемешали содержимое вихревым способом. Все флаконы инкубировали в рамках комнатной температуры (около 25оС в период прохождения эксперимента). После инкубации в течение 0, 1, 3, 5, 7, 14 и 21 дня, выживший вирус элюировали из образцов, используя 3%-ный раствор мясного экстракта. Эксперимент проводили дважды. В каждом эксперименте использовался тройной набор образцов, которые были комбинированы и использовались для титрации и внедрения в клетки.
После завершения испытаний, был измерен pH каждого образца, как с добавками, так и без них. Его уровень вычисляли путем добавления 50 мл деонизированной воды к 5 г корма, после чего в течение 15 минут в условиях комнатной температуры их непрерывно мешали при помощи магнитного перемешивающего устройства. После перемешивания, для определения количества pH в жидкости использовали пробу pH. Этот эксперимент производили трижды. Кроме вычисления pH, также сравнивались активные ингредиенты использованных добавок: Activate DA (2-гидрокси-4-метилтиобутановая кислота), KEM-GEST (фосфорная, фумаровая, молочная и лимонная кислоты), сахар (сахароза), Acid Booster (фосфорная, лимонная и молочная кислоты), соль (поваренная соль) и Ultracid P (ортофосфорная, лимонная, фумаровая и оксиянтарная кислоты).
Статистический анализ
Данные по инактивации активности (лог ЦПД50/мл) были изучены при помощи программы GlnaFiT (Geeraerd and Van Impe Inactivation Model Fitting Tool), встроенное бесплатное ПО на базе Microsoft Excel, разработанное Жираром и другими учеными. Традиционная прямо пропорциональная модель, которая предполагает линейные отношения между концентрацией вируса и временем обработки, была введена учеными Бигелоу и Эсти. Эту модель применяют, чтобы описать кривую выживаемости вируса ЭДС при помощи следующего уравнения:
В этом уравнении N – это титр вируса, выжившего после обработки (определяющийся по формуле ЦПД50/мл), N0 – это первоначальный титр вируса (ЦПД50/мл), k – это кинетический параметр (мин-1 или день-1), а t – это время обработки (минуты или дни). Кинетический параметр, как правило, выражен как D, также известный как «время десятикратного сокращения» (время, которое требуется при определенной температуре, чтобы избавить от 90% или 1 лога начального титра вируса). Этот параметр рассчитывается следующим образом:
Для описания способов нелинейной инактивации вируса при помощи различных микроорганизмов после термической и нетермической обработки, была задействована функция распределения Вейбулла. При условии, что термостойкость вируса определяется распределением Вейбулла, Мафарт и другие ученые разработали следующее вейбулльное уравнение:
В рамках этого уравнения, N – это выживший после обработки вирус, выраженный как ЦПД50/мл, N0 – это начальный титр вируса (ЦПД50/мл), δ – это время первого снижения логарифма распространения титра вируса (минуты или дни), а n – это параметр формы. Величина n определяет общее описание формы кривой; если n > 1, значит, кривая выпуклая (формирует «плечи»), если n < 1, значит, кривая вогнутая (формирует «хвосты»), а если n = 1, значит, кривая представляет собой ровную линию, и ее можно описать как линейную модель.
Чтобы оценить, насколько хорошо модели подходят для экспериментальных данных, были произведены два параллельных опыта. Скорректированный R2 (Adj. R2) вычисляется следующим образом:
Здесь m – это число наблюдений, j – это число параметров модели, а SSQ – это сумма квадратов.
Для определения статистических различий в процессе обработки был использован дисперсионный анализ с применением смешанной процедуры SAS (SAS Inst., Кэри, Северная Каролина). Для определения различий между способами обработки, был задействован метод наименьших квадратов, где P < 0.05 считалось значительной разницей. Экспериментальной единицей служила величина, полученная из объединения всех трех экземпляров флаконов. Зафиксированными эффектами были температура или примененная добавка.
Результаты
Термическая инактивация вируса ЭДС
Концентрация вируса (лог ЦПД50/мл) при 120, 130, 140 и 145оС показан в Графике 1 как функция времени. Кривая выживания показала нелинейное поведение, соответственно, для начала вирусной инактивации потребовалось воздействие на протяжении определенного времени. Кинетические параметры прямо пропорциональной и Вейбулльской моделей (величины D и delta) для каждой из температур показаны в Таблице 2. Вирус ЭДС показал высокую термостойкость в сухом корме и был полностью инактивирован (логарифмическое уменьшение на 3.0) при каждой из испытанных температур за 30 мин. Первоначально уровень жидкости в образце корма составлял 8.57% (масса/объем). После добавления 1 мл вируса уровень жидкости поднялся до 23.8%. Эта перемена в составе жидкости предположительно повысила способность жара понизить концентрацию вируса, поскольку термическая инактивация более эффективна при высоком уровне жидкости.
Модель Вейбулла обеспечила более точные результаты эксперимента, предоставив более высокий показатель adj. R2 (0.76-0.84), чем прямо пропорциональная модель (0.64-0.84). Показатель Delta уменьшался по мере увеличения температуры, что указывает на больший уровень инактивации. Чтобы достичь снижения вируса на 5 логарифмов, требуется воздействие в течение 82.6, 14.2, 10.5 и 6.5 минут при температуре 120, 130, 140 и 145оС соответственно.
Параметр формы (n) был больше чем 1 при всех температурах, кроме 120 оС, что объясняет появление выпуклой кривой на Графике 1. Показатель Delta при температуре 130, 140 и 145 оС отличался незначительно (P > 0.05).
Инактивация вируса ЭДС при помощи электронно-лучевой обработки
График 2 показал результаты инактивации ЭДС после электро-лучевой обработки. График отражает кривую инактивации, предоставленную моделью Вэйбулла, а точки иллюстрируют полученные величины. Величина delta при использовании модели Вейбулла была отмечена показателем 17.25 кГр. Выживание вируса ЭДС зависело от дозы: с увеличением дозы облучения повышался уровень инактивации. Чтобы достичь снижения вируса ЭДС в корме до 5 логарифмов, требуется доза в 86.25 кГр.
Результат инактивации вируса ЭДС с помощью пищевых добавок
Концентрация вируса в корме (контрольный образец) и комбикорме показана в Таблице 3. Добавки в корме понизили первоначальный титр вируса. Показатели D и delta прямо пропорциональной модели и модели Вэйбулла соответственно показаны в Таблице 4. Модель Вэйбулла показало больший уровень adj. R2, чем прямо пропорциональная модель, а потому именно она использовалась для характеристики выживаемости вируса ЭДС в корме с добавками во время хранения в условиях комнатной температуры. Величины delta для всех образцов с добавками, кроме добавки Ultracid P и соли, были значительно ниже, чем у контрольных образцов (P < 0.05), и показали более ускоренную инактивацию (Таблица 4). После 21 дня инкубации при комнатной температуре (25оС) наблюдалось снижение на 3 логарифма в образцах, содержащих KEM-GEST, сахар и соль. В тот же 21-дневный инкубационный период наблюдалось снижение на 2 логарифма в добавке Activate DA и <2 логарифма в контрольной группе, добавках Ultracid P и Acid Booster.
Сравнение всех пищевых добавок с точки зрения активного ингредиента и показателя pH отражено в Таблице 5. В целом, добавки, содержащие фосфорную кислоту, оказались более эффективными в борьбе с концентратом вируса. Наиболее эффективной оказалась единственная добавка, содержащая 2-гидрокси-4-метилтиобутановая кислоту (Activate DA). После помещения в корм добавок наблюдались различия в показателе pH.
Анализ
С тех пор как на свиноферме в Канаде был впервые зафиксирован вирус ЭДС, предполагалось, что он передается другим свиньям через пищу. Последующие эпидемиологические исследования показали, что потенциальным источником вируса ЭДС может быть сухая плазма, которая применяется при откорме поросят. Во время биоопыта, однако, выяснилось, что зараженный образец плазмы, добавленный взрослым свиньям в комбикорм, не оказал никакого воздействия.
При изучении эпидемии вируса ЭДС в Огайо также пришли к заключению, что он передается через корм или его ингредиенты. В приведенном случае, вирус был обнаружен в корме при помощи технологии ОТ-ПЦР на ферме с зараженными свиноматками. Однако по результатам последующего биоопыта, ни у одной из свиней, потреблявших зараженный корм, не обнаружилось инфекции. В этом исследовании, таким образом, также не был найден источник заражения, хотя проверка ОТ-ПЦР показала наличие вируса.
Группа ученых выяснила, что если экспериментально добавить в корм ДНК вируса, то он вызовет заражение, но только если корм будет потребляться в нормальных условиях. Предполагают, таким образом, что если корм оказывается заражен вирусом, то есть вероятность, что он передастся свиньям, однако при потреблении на ферме. В целом, эти результаты требуют дополнительного исследования для того, чтобы оценить возможные превентивные меры для контроля передачи вируса ЭДС через корм.
В первую очередь, выживаемость вируса ЭДС в корме была проверена термически при температуре от 120 до 145оС в течение 0-30 минут. Предшествующие исследования сосредотачивались на выживаемости вируса при температуре ниже 80оС. Согласно одному из исследований, культивированные клетки вируса были умеренно стабильны при температуре в 50 оС в течение 30 минут. Снижение было всего на 0.4 лог10 БОЕ/мл по сравнению с контрольным образцом. Последующие исследования были посвящены изучению вируса при получасовых температурах 60-80 оС. Эти исследования показали, что в таких условиях инфекция полностью уходит, однако концентрация вируса не была определена. Согласно другому исследованию, инактивация дикого вируса в образцах фекалий до того уровня, когда он не мог бы причинить вред свиньям, потребовала всего 10 минут при температуре 71 оС. Это разнообразие реакций на попытки нейтрализовать вирус объясняется разнице в количестве жидкости в испытуемых образцах. Уровень жидкости оказывает значительное влияние на выживаемость вируса во время термической обработки.
Хотя в этих исследованиях различались время и температура обработки, однако результаты соответствуют ранее известным данным о том, что вирус ЭДС имеет низкую теплостойкость. Наша гипотеза заключалась в том, что термическая обработка корма снизит выживаемость вируса ЭДС в свином корме. Эта гипотеза подтвердилась экспериментальным путем. Результаты эксперимента показали, что за 25 минут обработки при температуре 120 оС достигается снижение концентрации вируса на 3 логарифма (99.9%). Эти результаты также позволяют подчеркнуть, что температуре выше 130 оС не повышает инактивацию вируса. Это важное наблюдение, поскольку чрезмерное нагревание белковых ингредиентов приводит к понижению перевариваемости аминокислот из-за реакции Майяра.
Помимо снижения концентрации вируса в корме при высоких температурах в соответствии с логарифмом, любопытные результаты показывает выпуклая кривая, образованная по модели Вейбулла. Она может означать, что при определенном сочетании времени и температуры выживаемость вируса выше, а для достижения максимального уровня инактивации вируса необходимо достичь крайней границы. Другая возможная причина выпуклости кривой – это вероятность того, что корм был охлажден, когда был добавлен инокулюм комнатной температуры. Это означало бы, что первые несколько минут нахождения в камере корму потребовались для того, чтобы вернуться к прежней температуре, что объяснило бы кривую концентрации вируса. В целом, результаты нашего эксперимента подтверждают, что концентрация вируса ЭДС в комбикорме может быть понижена при использовании термической обработки.
При нетермических способах обработки корма для снижения концентрации вируса ЭДС, была применена доза электронно-лучевой радиации размером 50 кГр. Этот способ оказался эффективным, снизив концентрацию вируса на 3 логарифма (99.9%). В настоящий момент, Управление по контролю за продуктами и лекарствами ограничило максимально допустимую дозу облучения в животных кормах до 50 кГр. Использование электронно-лучевой обработки в животных кормах оказалось эффективным с точки зрения нейтрализации патогенных факторов. Животные корма и контейнеры (весом около 20 кг) допускаются к электронно-лучевой обработке.
Благодаря контрольным образцам, есть возможность определить максимальную и минимальную дозы в контейнерах, чтобы соответствовать требованиям клиента и не превысить допустимый лимит. Хотя нам удалось выяснить, что облучение является эффективным способом понизить концентрацию вируса ЭДС в свином корме, требуются дополнительные исследования, чтобы подтвердить полученные нами результаты в других видах кормов. Наши экспериментальные данные, согласно которым доза в 50кГр приводит к снижению от 3 до 10 логарифмов вируса, важны тем, что они подчеркивают, насколько облучение способно снизить концентрацию вируса, если использовать его в промышленной технологии. Согласно этим результатам, при стартовой бионагрузке больше чем 4 лог10 ЦПД50, максимально допустимой дозы в 50 кГр может оказаться недостаточно эффективной для полной нейтрализации вируса в корме.
Кроме того, если станут известны максимальные титры вируса в промышленном свином корме, можно будет рассчитать дозу, которая теоретически достигнет полного избавления от вирусных клеток. Вдобавок к определению, каков максимальный титр вируса, также может быть необходимо выяснить, какое действие облучение оказывает на отдельные ингредиенты. Наш эксперимент только оценил действие радиации на комбикорм в целом, поэтому пока что нельзя сказать, как она повлияет на отдельные ингредиенты.
Наконец, мы проследили выживаемость вируса ЭДС в корме при использовании различных пищевых добавок в дозах, рекомендованных производителями. Эксперимент с добавками проводился только при комнатной температуре. На свиноферме корм может храниться при разных температурах, в зависимости от времени года, расположения свинарника, условий хранения корм, температуры в свинарнике и других факторов. Комнатная температура была выбрана как усредненная температура, хотя результаты, полученные в этих условиях, могут оказаться применимы не для всех ситуаций. Рекомендуется хранение корма в прохладном сухом месте, поэтому велика вероятность, что некоторые корма будут храниться при температуре ниже 25оС, задействованной в данном эксперименте.
Добавление органических кислот в свиной рацион показало увеличение перевариваемости полезных веществ путем снижения pH и улучшения микрофлоры кишечника, что значительно улучшает и производительность свиньи, позволяя отказаться от использования антибиотиков для нормализации рациона свиньи. Органические кислоты применяются, чтобы понизить превалирование бактериальных патогенов, таких как сальмонелла в корме птиц.
В рамках дополнительного эксперимента, для снижения уровня вируса ЭДС в корме был задействован противомикробный препарат SalCURB, который обычно используют для предотвращения сальмонеллы. В данном эксперименте биопроба показала, что корм, в котором присутствует SalCURB, не вызывал инфицирования у поросят. Однако так и не было выяснено, каким именно образом препарату удалось инактивировать вирус.
Следует отметить, что наблюдаются различия в выживаемости вируса не только в зависимости от примененной добавки, но и на основании сочетаемости ингредиентов. В эксперименте, в котором было задействовано 18 различных ингредиентов корма, было выяснено, что выживаемость вируса ЭДС в этих ингредиентах была разной, причем самая высокая концентрация вируса была обнаружена в соевой муке. Это указывает на то, что даже такое небольшое отклонение, как смена ингредиентов, может привести к появлению вируса в корме.
Было выяснено, что вирус ЭДС проявляет стабильность при pH 6.5-7.5 при температуре 37оС. Поскольку кишечные вирусы выживают в кислой среде желудка, они, в целом, менее подвержены воздействию кислотного pH. Учитывая это, изменения в pH вне идеальных условий на длительный период могли бы вызвать повышение возможности инактивации вируса. Согласно предшествующему обзору, pH в рационе понизился от среднего 5.96 до 4.71, когда органические кислоты (фумаровая, пропионовая, муравьиная, лимонная, лимоннокислая, соляная, натриевая или оксиянтарная кислоты) были добавлены в корм. Это понижение уровня pH предположительно понижало и выживаемость вируса ЭДС в кормах с добавками.
Результаты нашего исследования, однако, не доказывают эту гипотезу. Activate DA и KEM-GEST были самыми эффективаными средствами снижения выживаемости вируса и также показывали самые кислотные величины pH при добавлении в корм, что подтверждает гипотезу. Однако Ultracid P не показал отличия pH, хотя показатель delta у него был самым высоким среди всех проанализированных добавок. Кроме того, образец корма требовал добавления в него какой-либо жидкости для того, чтобы pH вообще играло какую-либо роль, поскольку в сухих субстанциях pH не содержится.
В эксперименте к образцам был добавлен 1мл вируса, после чего все перемешали. Это означает, что pH вируса мог измениться из-за добавки еще тогда, когда вирус был только внедрен. Если это изменение объясняет разницу в выживаемости в рамках нашего эксперимента, между pH кормового раствора и наблюдаемой величиной delta будет более понятная взаимосвязь. Без четкой связи между pH и выживаемостью вируса, а в некоторых случаях и при отсутствии каких-либо различий между pH раствора в контрольной группе и некоторых добавках, существует также еще один аспект, вызывающий изменения в выживаемости вируса в использованных добавках.
Если объяснить снижение выживаемости вируса ЭДС одними только изменениями в pH не представляется возможным, это значит, что существуют и другие компоненты пищевых добавок, которые способны снизить выживаемость вируса. Мы предположили, что в различиях между уровнем выживаемости вируса в разных добавках важную роль играют специфические активные ингредиенты. Ранее было указано, что лимонная и молочная кислоты имеют лишь умеренную антимикробную активность, поскольку их эффективность повышается в среде низкого pH. Поскольку большинство образцов свиного корма имели нейтральный pH, неудивительно, что добавки, содержавшие лимонную кислоту в качестве активного компонента могли быть не так эффективны в инактивации вируса.
С другой стороны, предшествующие исследования показали, что фумаровая кислота обладает значительным антимикробным эффектом, а потому является крайне эффективной в снижении выживаемости кишечной палочки. На данный момент не проводилось специальных исследований, подтверждавших бы, что фумаровая кислота является эффективным противовирусным компонентом, однако ее наличие в KEM-GEST, которая показала один из самых лучших результатов по снижению уровня выживаемости вируса в нашем исследовании, позволяет предположить, что именно этот ингредиент может иметь ведущий эффект.
Активный ингредиент Activate DA, самой эффективной в рамках нашего исследования добавки, – это 2-гидрокси-4-метилтиобутановая кислота. Этот компонент отдельно изучался как экономически выгодный ингредиент в свиных рационах, где требуется низкий уровень метионина. Хотя никакими исследованиями не подтверждено использование этой кислоты как антимикробного или антивирусного препарата, по результатам нашего анализа можно предположить, что потенциально она может снижать выживаемость вируса.
В целом, внимательный выбор добавок, содержащих наиболее эффективные активные ингредиенты, необходимое условие достижения успеха в борьбе с вирусом ЭДС в свином комбикорме. Для подтверждения относительной эффективности каждого из активных ингредиентов и для изучения того, как они могут взаимодействовать друг с другом, необоходимы дополнительные исследования.
Одним из ограничений данного исследования является неопределенность активности воды. При добавлении в образцы жидких элементов, уровень жидкости этих образцов значительно повышался. Это усиление влажности предположительно вызвало изменения в инактивации вируса при термальной обработке образцов, которых не было при низкой влажности корма. Выяснилось, что инактивация вируса ЭДС при помощи тепловой обработки и изменений в pH в жидкой субстанции отличаются от сухого плазмического продукта.
Поскольку наши эксперименты рассматривали как изменение pH при помощи добавок, так и изменения при тепловой обработке, повышенная влажность внедренного образца могла вызвать разную кинетику инактивации, что может отличаться от таковой в сухой субстанции. Кроме того, влажность окружающей среды не была зафиксирована, также как не рассчитывалась водная активность образцов. Без учета этих параметров, невозможно точно определить роль, которую они играли в инактивации вируса ЭДС в обазцах корма. Помимо неизвестно активности воды, этот эксперимент также ограничивает низкое содержание вируса в начальных титрах. В связи с этим, достичь стандарта полной инактивации (как правило, снижение на 7 логарифмов) не представляется возможным, поскольку стартовые титры вируса составляли всего 4 логарифма.
Наши результаты демонстрируют, что выживаемость вируса ЭДС можно сократить при помощи электронного облучения или термической обработки при температурах свыше 130оС. Также эффективным может оказаться применение определенных пищевых добавок, однако в этой области требуются дополнительные исследования, которые помогут определить самый эффективный вариант инактивации вируса (время и температура термической обработки, доза облучения и выбранные добавки).
Выводы
Предположительно, корм является возможным переносчиком вируса ЭДС. В связи с этим, возникла необходимость оценить новые и существующие способы обработки корма, чтобы снизить выживаемость вируса в нем. Результаты настоящего исследования показали, что как термическая (130оС минимум на 15 минут), так и нетермическая (доза облучения в 50 кГр) технологии обработки могут унчтожить до 99.9% клеток вируса, если речь идет о низком его титре (6.8х103 ЦПД50/мл). Кроме того, выживаемость вируса можно сократить при помощи определенных окислителей и органческих кислот, добавленных к свиному корму.
