Статьи по ветеринарии свиней на Piginfo | Реакции взаимодействия антиген - антител

Печать

Реакции взаимодействия антиген - антител

Реакции между антигенами и антителами in vitro, имеющие диагностическое значе­ние, называли серологическими (от лат. sеrum - сыворотка), так как источником антител служила сыворотка крови. При появле­нии методов иммунохимического анализа серологические реакции стали одной из широкого набора реакций, выявляющих механизмы взаимодействия между антигенами и антителами. Если на раз­ных этапах развития иммунологии в качестве антител для постанов­ки серологических реакций использовали только сыворотку крови, теперь благодаря разнообразным методам выделяют из нее высоко­очищенные иммуноглобулины. для индикации и количественной оценки того или иного вещества антигенной природы предложены способы получения высокоспецифичных (моноспецифичных) ан­тител и высокочувствительные методы регистрации концентрации отдельных компонентов реакции антиген - антитело. Это стало возможным в связи с разработкой способов конъюгирования анти­генов и антител с флуоресцирующими красителями и ферментами, введения компонентов реакции антиген - антитело на различных типах носителей. Достижения современной иммунохимии позво­лили проводить реакции антиген - антитело на уровне, который вряд ли можно назвать серологическим, хотя источником антител продолжает оставаться сыворотка крови. Понятие «серологическая реакция» окончательно отпадает, когда речь заходит о взаимодей­ствии антигена с моноклональными антителами, получаемыми бла­годаря разработке гибридомной техники, и когда реакция анти­ген - антитело протекает при аллергии.


Антитела в зависимости от свойств антигена и условий взаимо­действия с ним обладают нейтрализующим, иммобилизирующим, коагулирующим (осаждающим) и лизирующим (растворяющим) действиями. Нейтрализующее действие проявляется в реакциях нейтрализации токсина антитоксином, иммобилизирующее - в иммобилизации некоторых микроорганизмов, коагулирующее - в реакциях агглютинации и преципитации, лизирующее - в реак­циях лизиса и связывания комплемента. Каждая из разновиднос­тей серологических реакций имеет свои варианты, а их постанов­ка - различные модификации, поэтому методические подходы к проведению реакций между антигеном и антителом довольно раз­нообразны.


Реакция нейтрализации (РН). В ходе реакции нейтрализации специфические антитела нейтрализуют вредное действие антигена, которое проявляется при попадании послед­него в организм. Если антигеном служит микробный экзотоксин (дифтерийный, столбнячный, ботулинический и др.), то специфи­ческие антитела нейтрализуют его. В организме происходит ней­трализация только свободного, не связавшегося с клетками токси­на. Обезвреживание токсина в ходе физико-химической реакции нейтрализации происходит за счет связывания его свободных ами­ногрупп, что приводит к потере токсичности. Если антигеном слу­жит вирусный материал, нейтрализующие антитела полностью подавляют специфическую активность вируса, выявляемую в раз­личных клеточных культурах, куриных эмбрионах и на подопыт­ных животных. Вирус перестает размножаться, теряет свою ин­фекционность.


Реакция агглютинации (РА). Различают прямую и непрямую, или пассивную, агглютинации. В прямой агглютина­ции в качестве антигена выступает сама микробная клетка или структурные компоненты ее поверхностной оболочки. Предел чувствительности реакции агглютинации микробов составляет 0,01 мкг азота белка антител в 1 мл.


Агглютинация обусловлена в большей степени особенностями строения клеточной оболочки и ее функциями, нежели свойства­ми агглютининов. Fab-фрагменты антител могут блокировать антигенные детерминанты, не приводя непосредственно к склеива­нию. Агглютинации способствует расположение антигенных ре­цепторов клеточной поверхности в виде скоплений. Если много­валентные агглютинины взаимодействуют одновременно с нес­колькими антигенными рецепторами, константа Ка повышается по сравнению с Ка для случаев соединения антитела с антигеном единичной связью.


При пассивной агглютинации растворимые антигены (белки, полисахариды и их комплексы микробного происхождения) со­единяются с нерастворимым носителем, выполняющим исключи­тельно индикаторную функцию. Носителями могут быть эритро­циты, частицы латекса, полиакриламида, бентонита и др. Связы­вание антигена с носителем происходит в результате адсорбции или химического взаимодействия. Микробные полисахариды, на­пример, адсорбируются на нативных эритроцитах без какой-либо их предварительной обработки. Различные белки (в том числе микробные фрагменты) возможно при соединить к эритроцитам, только обработав их различными химическими веществами, обла­дающими дубильным действием, - танином, хромахлоридом, фор­мальдегидом или бисдиазотированным бензидином. Такая об­работка предотвращает разрушение эритроцитов, которое может про изойти при непосредственном их контакте с антигеном. При условии, если антиген, связанный с носителем, соответствует ан­тителу, происходит агглютинация.


Реакция преципитации (РП). Реакция антиген­-антитело представлена преципитацией. Основана на осаждении антигена из раствора специфическими антителами. Комплекс ан­тиген - антитело выпадает в осадок только при определенных со­отношениях концентраций реагирующих молекул. Область этих соотношений, при которых в надосадочной жидкости после обра­зований преципитата не обнаруживаются ни свободные антигены, ни свободные антитела, называется зоной эквивалентности. Вне этой зоны, при избытке антител или антигена, феномен преципи­тации не происходит, так как образуется растворимый комплекс антиген - антитело. Реакция преципитации менее чувствительна, чем реакция агглютинации.


Существуют модификации реакции преципитации. Самый про­стой способ постановки -  кольцепреципитация, которую выполняют в пробирках путём наслоения на иммунную сыворотку раз­личных разведений прозрачного раствора антигена. На границе двух реагирующих систем через определенное время появляется опалесцирующее серо-белое кольцо преципитации. Именно та­ким образом при изучении стерильных фильтратов бульонных культур возбудителей холеры, брюшного тифа, чумы, сибирской язвы и соответствующих антисывороток в конце XIX века (1897) были обнаружены преципитины.


Реакция преципитации может быть поставлена в агаровом геле (иммунодиффузия по Ухтерлони). Принцип этого метода заклю­чается в следующем. Растворимые антигены и антитела вносят в лунки, вырезанные в геле на определенном расстоянии. Компо­ненты реакции диффундируют в слое агара навстречу друг другу, образуя в зоне контакта преципитат в виде мутной видимой линии преципитации.


Для более детальных иммунологических исследований приме­няют метод иммуноэлектрофореза, предложенный П. Грабаром и К. А. Уильямсом (1953). Вначале осуществляют электрофорети­ческое разделение антигена, представляющего собой зачастую смесь белковых или других молекул в забуференном агаровом геле. После разделения в канавку, которая идет в направлении миграции антигенных веществ, вносят преципитирующую сыво­ротку. Антиген и антисыворотка диффундируют в геле навстречу друг другу, и в месте их взаимодействия возникают дугообразные линии преципитации. По числу, положению и форме этих линий дают заключение о составе исходной смеси антигенов.


Реакция лизиса (РЛ). Лизирующее (растворяющее) действие антител наглядно проявляется в реакциях лизиса и свя­зывания комплемента. В основе реакций лизиса лежит взаимодей­ствие корпускулярных антигенов со специфическими антителами. Иммуноглобулины при содействии комплемента разрушают эри­троциты, ИЗ которых выходит гемоглобин и реагирующая смесь из мутной взвеси эритроцитов преобразуется в прозрачную красную жидкость, так называемую лаковую кровь. Реакция названа реак­цией гемолиза. Когда иммуноглобулины также при содействии комплемента разрушают оболочку бактериальной клетки, наблю­дается лизис бактерий - бактериолизис.


Реакция связывания комплемента  (РСК). Механизм действия наиболее сложный в сравнении с другими серологическими реакциями. В РСК участвуют две системы ан­тиген - антитело. Для визуальной регистрации связывания комплемента основной системой антиген - антитело в реакцию дополнительно вводят вторую, или индикаторную, систему, со­стоящую из взвеси эритроцитов и соответствующей антисыво­ротки (гемолитической сыворотки). Если основной комплекс антиген - антитело фиксировал в себе комплемент (в случае соответствия антигена антителу), то гемолиз отсутствует (положительная реакция). Если в основной системе антиген и антитело не соответствуют друг другу, то комплемент фиксируется на вто­ром индикаторном комплексе, вызывая гемолиз эритроцитов (ре­акция отрицательная). По чувствительности РСК примерно соот­ветствует реакции пассивной гемагглютинации.


Реакция иммунофлуоресценции (РИФ). В ос­нову иммунофлуоресцентного метода положено взаимодейст­вие антигена с антителом, при котором один из компонентов реакции (чаще антитело) обладает способностью к вторичной флуоресценции благодаря предварительному соединению с флуо­ресцентным красителем. Образовавшиеся таким образом им­мунные комплексы становятся хорошо видимыми, ярко светя­щимися структурами на темном фоне под флуоресцентным микроскопом. В качестве флуоресцентных красителей исполь­зуют флуоресцеин, изотиоцианат, родамин, В-изотиоцианат, лис­самин-родамин и другие, имеющие реакционно-способные груп­пы (сульфохлорид, изотиоцианат и др.), которые соединяются со свободными аминогруппами молекул антител, не теряя при обработке флуорохромами специфического связывания с соот­ветствующим антигеном.


Прямой инепрямой флуоресцентные методы. Прямой метод ос­нован на непосредственном специфическом соединении антигена с мечеными антителами. Непрямой метод - на поэтапном выяв­лении комплексов антиген - антитело с помощью флуоресцент­ных красителей. Первый этап заключается в образовании иммун­ных комплексов определенного антигена (например, бактериаль­ной клетки) со специфическими антителами (у-глобулинами) им­мунной сыворотки. Второй этап - в выявлении этого комплекса путем обработки его меченым анти-у-глобулином.


Обнаружение иммуноглобулинов иммунофлуоресцентным ме­тодом возможно, если антиген, использованный iп vitro для обра­зования антител, представляет собой растворимый белок. В этом случае он может быть конъюгирован с флуорохромом и В таком виде использоваться для обнаружения гомологичных антител.


Иммуноферментный анализ (ИФА). В основу метода положена конъюгация антитела или гаптена с Ферментом, которая не приводит к утрате антителом или гаптеном специфич­ности, а ферментом - каталитической активности. Однако в соста­ве комплекса антиген - антитело конъюгаты гаптен - фермент или антитело - фермент теряют свою каталитическую активность.


Соединение молекул антигена с ферментом осуществляется с помощью глутаральдегида - бифункционального реагента, взаи­модействующего с Е-аминогруппами белковых молекул. В каче­стве фермента успешно применяют в зависимости от модифика­ции метода либо пероксидазу, l3-галактозидазу, щелочную и кис­лую фосфатазы (реже ацетилхолин, глюкоамилазу), либо лизоцим, глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназу и малатдегидрогеназу. Используемый для маркировки антител фермент не должен присутство­вать в исследуемых клетках, содержащих антиген.


Иммуноферментные методы первоначально были разработаны для гистохимических исследований. Принцип иммуногистохими­ческого анализа с использованием ферментов заключается в сле­дующем. Антитела, маркированные ферментом, соединяются со специфическим антигеном, фиксированным на твердом носителе (полистироловая пластина или другие непористые полимеры), об­разуя невидимый комплекс. Выявление иммунных комплексов, содержащих фермент, проводится с помощью цветной реакции, происходящей при добавлении фермент-специфического субстра­та. Окрашенный комплекс антиген - антитело выявляется в све­товой или электронной микроскопии.


В дальнейшем методы иммуноферментного анализа стали при­менять для количественного определения антигенов и антител в биологических жидкостях. Были созданы гетерогенные (твердо­фазные) и гомогенные методы, принципиально отличающиеся способом разделения компонентов иммунохимической реакции. Гомогенный метод характеризуется протеканием реакции анти­ген - антитело в гомогенном растворе, и этап физического разде­ления реагентов и продуцентов реакции не обязателен. Твердо­фазные методы основаны на применении антител (или антиге­нов), иммобилизованных на нерастворимых носителях, гомоген­ные методы - на эффекте модуляции антителами активности фермента, связанного с антигеном. В основу гомогенных методов положен принцип конкурентного взаимодействия меченого и не­меченого гаптена с активными центрами антител. Чем больше свободного гаптена введено в реакцию до прибавления меченого гаптена, тем меньшее количество последнего будет связано с ан­тителами. Соответственно и ферментативная активность в раство­ре изменится незначительно. Наоборот, чем меньше свободного гаптена ввести в реакцию, тем большее количество ковалентного соединенного с ферментом гаптена уйдет в иммунный комплекс, а ферментативная активность в растворе существенно понизится.


Определение неизвестной концентрации гаптена в образце осу­ществляют по заранее выведенной калибровочной кривой, для пост­роения которой устанавливают зависимость активности фермента в данной системе от стандартных концентраций свободного гаптена.


В твердофазном иммуноферментном анализе наряду с конку­рентными методами распространены подходы, основанные на последовательном взаимодействии фиксированных на носителе иммуноглобулинов с антигеном (или наоборот), а затем с имму­ноферментным конъюгатом, представляющим собой меченные ферментом антитела против иммуноглобулинов (сэндвич-метод, от англ. sandwich - бутерброд).


Радиоиммунологический анализ (РИА). В ра­диоиммунологическом анализе специфичность реакции антиген- антитело сочетается с высокой чувствительностью, обеспечивае­мой применением радиоактивной метки, благодаря которой мож­но определить количество азота антител до 1х10-8 мг/мл. Для проведения анализа необходимо иметь антисыворотки и гомо­логичные антигены, маркированные каким-либо изотопом йода (125j, 131j), равно как и гаптены, маркированные 14С или 3Н. Чув­ствительность метода существенно возрастает при использовании высокоаффинных антител с низкой перекрестной реактивностью и антигенов с высокой удельной радиоактивностью. В основу ра­диоиммунологического анализа положен принцип конкурентного взаимодействия определяемого немеченого антигена и известного количества меченого антигена с активными центрами антител. При этом происходит вытеснение меченого антигена или гаптена из его комплекса с антителом вследствие последующего добавле­ния больших концентраций немеченого антигена или гаптена той же специфичности. Реакция (при высоком разведении ингредиен­тов) подчиняется закону действующих масс: происходящее вытес­нение пропорционально введенному количеству не меченого ан­тигена или гаптена. Конкуренцию между определяемым и мече­ным антигенами можно оценить количественно с помощью ра­диометрии, предварительно отделив образовавшиеся иммунные комплексы от несвязавшегося меченого антигена. Концентрацию определяемого антигена рассчитывают, исходя из сравнения соот­ношений свободного и связанного меченых реагентов с соответ­ствующим стандартом.

 

Статьи партнеров

Гарт Браун, Генеральный управляющий канадского центра по искусственному осеменению Gene Transfer – Genesus Inc. Каждый согласится с утверждением, что хряк – это очень важ...

30.12.2019 246

Новорожденные поросята и птенцы сталкиваются с различными проблемами, от решения которых зависит их выживание: нехватка тепла, доступ к пище, бактериальные и экологические угрозы...

16.12.2019 567

Целью команды научных сотрудников Topigs Norsvin является разработка инструментов, необходимых для удвоения генетического прогресса среди наших животных на товарных фермах. На пр...

04.12.2019 175

Динеш Теккот, Доктор наук, Genesus Inc. Продолжительность продуктивной жизни свиноматки в товарном производстве является ключевым экономический фактором, поскольку она прямо ...

01.12.2019 116

Isospora suis – энтеропаразит свиней, который вызывает кокцидиоз у новорожденных поросят. Желтая пастообразная диарея является наиболее характерным клиническим признаком заболева...

06.11.2019 99

Пол Андерсон, Генеральный управляющий компании Genesus в Юго-Восточной Азии и Управляющий отделом зарубежных продаж Genesus Inc. Филиппины [ /upload/medialibrary/11b/cont...

10.10.2019 74

Саймон Грей, Генеральный директор Genesus в России, странах СНГ и Европы, Genesus Inc. В России цена убойных свиней несколько снизилась и в настоящее время установилась на у...

30.09.2019 61

Эверест Аккано, доктор наук, генетик Genesus Inc. Отбор ремонтного молодняка – животных, которые станут родителями будущих поколений свиней в программах племенной работы ну...

30.09.2019 77

Спешим поделиться замечательной новостью: наконец-то завершен проект по организации выставочного центра оборудования Comax|FTG для свиноводства. Отличительной особенностью вы...

25.09.2019 55

Нам известно, что: - Стоимость корма составляет 60-80% стоимости производства свинины - Тип кормушки имеет существенное влияние на контроль за стоимостью корм...

23.09.2019 71

Традиционно комбикорм для сельскохозяйственных животных состоит из основных компонентов: - Макроингредиенты: зерновое сырье, отруби, шрота, жмыхи, рыбная и мясокостная мука...

04.09.2019 133